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酶免疫技术 信阳职业技术学院 药学与检验系 第一节 概述 酶免疫技术的原理 酶及其底物 酶标记抗体（抗原）的方法 酶标记物的纯化与鉴定 固相酶免疫测定仪 酶免疫技术的类型 一、原理 酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。 将酶与抗体（或抗原）结合成酶标记抗体（或抗原），此结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。在酶标抗体（或抗原）与抗原（或抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原（抗体）进行定位、定性或定量的测定分析。 二、酶及其底物 酶的选择要求 常用的酶 常用的底物 （一）酶的选择要求 一个酶蛋白分子每分钟可催化103~104个底物分子转变成有色产物。用酶标记抗体（或抗原）建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度。 用于标记的酶应符合的条件 ① 酶活性高，能对低浓度底物产生较高的催化反应率。 ②具有可与抗原、抗体共价结合的基团，标记后酶活性保持稳定，而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。 ③酶催化底物后产生的信号产物易于判定或测量，且方法简单、敏感和重复性好。 用于标记的酶应符合的条件 ④酶活性不受样品中其他成分（内源性酶、抑制物）的影响；用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性出现抑制或激活。 ⑤酶、辅助因子及其底物均对人体无危害，理化性质稳定，且价廉易得。 （二）常用的酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） b-半乳糖苷酶(b-Gal ) 其他的酶 1．辣根过氧化物酶（HRP） HRP因在蔬菜植物辣根中含量最多而得名。 它是由糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）结合而成的复合酶，分子量约40kD，等电点为pH5.5~9.0。主酶为无色蛋白，最大吸收光谱为275nm，辅基是酶的活性中心，最大吸收光谱为403nm。 2．碱性磷酸酶（AP） 是一种磷酸酯的水解酶。因其分子量较大（80~100kD），不易透入细胞内，故很少用于E I H，但因其敏感性高、空白值低，也常用于E I A。 3.β半乳糖苷酶(b-Gal ) b-Gal源于大肠埃希菌，分子量540kD，最适作用pH6-8。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标记物在测定时不易受到内源性酶的干扰，因此也常用于均相酶免疫测定。 （三）常用的底物 1．HRP的底物 2．AP的底物 3. β半乳糖苷酶底物 三、酶标记抗体（抗原）的方法 戊二醛交联标记法 改良过碘酸钠标记法 四、酶标记物的纯化与鉴定 酶标记物的纯化 酶标记物的鉴定 五、固相酶免疫测定仪 （一）性能指标 1.测定波长 2.测定的吸光度范围 3.光学系统 4.检测速度 5.震板功能 6.温育功能 7.软件功能 （二）仪器类型 1. 微孔板固相酶免疫测定仪 2.管式固相酶免疫测定仪 3.小珠式固相酶免疫测定仪 4.微粒固相酶免疫测定仪 5.磁微粒固相酶免疫测定仪 （一）性能指标 1.测定波长 450nm和492nm 两个波长是ELISA法最常用的。 除了这两个基本滤片外，由于双波长比色的需要，还应配有620nm和405nm波长的滤光片。 2.测定的吸光度范围 酶标仪的吸光度测定范围在0~2.5之间就可以满足ELISA测定的需要。 现在酶标仪一般拓宽至3.5以上，并能保持很好的线性和精密度。 3.光学系统 酶标仪光学系统采用的是垂直光路多通道检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均是通过酶标仪测定的吸光度、线性、精密度和准确度等指标体现出来的。 4.检测速度 酶标仪检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。 速度快利于提高检测的准确性，避免因时间不同所致的各微孔之间吸光度的差异。目前生产的酶标仪检测速度均较快，一般在数秒内即可完成全部测试。 5.震板功能 酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行震荡混匀，使板孔内颜色均一，避免沉淀对测定的影响。 6.温育功能 温育功能是酶标仪的一个附加功能，是指酶标仪本身能按要求自动精密地控制仪器内部的温度，使得ELISA微孔板条的温育过程可在仪器内部进行，而无需再配置温箱。 7.软件功能 软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定进行统计分析并报告结果的功能。在ELISA定性测定中，酶标仪若具有阳性判断值（Cut-off）和测定“灰区” 的统计计算功能。 在ELISA定量测定中，则在酶标仪的软件功能中应有曲线回归方程计算功能。其他功能如质控记录、质控曲线、数据保存等可根据需要而定。 （二）仪器类型 由于测