转基因植物制药.pptVIP

植物转基因的主要方法 农杆菌介导的基因转移 以原生质体或细胞（组织）作为受体的直接基因转移，如： 聚乙二醇法（PEG） 电击（EP ，electroporation） 脂质体（Lip， Lome） 磷酸钙－DNA共沉淀（Ca－P） 微注射（Mi ，Microinjection） 基因枪法（particle bombardment，简称PB） 超声波法（Ulstrasonication） 种质系统（germ line transtormation）的基因转移，如利用子房注射 、种胚以及花粉管通道等导入外源基因 1.1植物冠瘿瘤——植物的一种癌症 1.1冠瘿瘤 植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的因素有：受伤、昆虫、病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤。 1.1.1冠瘿瘤的起因 由根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）[属根瘤菌科（Rhizobiaceat）]对植物的侵染而引起。 1.1.2冠瘿瘤的侵染过程 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。 冠瘿瘤 1.1.3 冠瘿瘤的一般生物学特性 45℃杀死侵染植物的根癌农杆菌，植物组织仍然能形成癌。把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限止的分裂和生长。 （1）根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有一个叫作Ti（tumor-inducing）的质粒（Ti plasmid）。 （2）根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质：类植物激素和冠瘿碱。类植物激素使细胞大量扩增，出现冠瘿瘤；冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸，包括胭脂碱、章鱼碱等。冠瘿碱是根癌农杆菌生活的C、N和能量来源。 1.2 Ti质粒 1.2.1 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95～156× 106D，约有200kb。最近有人发现农杆菌中还有其它的质粒，称之为隐秘质粒。稳秘质粒的功能还不清楚，有的认为可能是缺陷型的Ti质粒。迄今已从多种植物中分离出不同种类的根癌农杆菌。 1.2 Ti质粒 1.2.2 Ti质粒的物理图谱 物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA上的排列顺序。 Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处理之后的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分离，便可显示出有20多条大小不同的DNA酶切片段。然后将这些酶切片段进行分子杂交分析，测定顺序，再排列成完整的物理图。 1.2 Ti质粒 1.2.3 Ti质粒的基因图谱 基因图谱：基因在Ti-DNA上的排列顺序。 基因图谱构建：转座子标签法 利用细菌的转座子（transposon），使Ti质粒发生嵌入突变和缺失突变。细菌转座子带有各种抗菌素抗性的基因，在转化过程中它们可嵌入Ti质粒，使根癌农杆菌带有相应的抗菌素抗性，因而可方便地筛选出转座子嵌入Ti质粒突变体。由于在转座子嵌入处的编码基因发生失活，因而可通过分析Ti质粒限制性内切酶片段的变化，如某些片段消失或电泳迁移率改变，确定这些基因插入位置，并且与突变体的表型相对应，从而建立Ti质粒的基因图。 目前已建立了十多个Ti质粒的基因图，其中主要是章鱼碱型和胭脂碱型两大类的Ti质粒基因图。 1.2 Ti质粒 Ti质粒的基因图谱 不同的Ti质粒有二个同源区： ①Vir区（转化所必须） 是毒性区，也叫毒性基因或Vir基因或致病基因。 ②T－DNA（transforming DNA） T－DNA是Ti质粒的转化植物的DNA，故称T－DNA。在转化植物细胞二倍体基因组中含有一个或几个（至多）T－DNA拷贝。noc是编码细菌利用胭脂碱的基因。 1.2 Ti质粒 1.2.4 Ti质粒的基因位点及其功能区域 （1）T－DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region）： 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。 1.2 Ti质粒 （3）Con区（regions encoding conjugations）： 该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti