乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离.pptVIP

乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离 实验目的要求 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的操作技术。 实验原理乳酸脱氢酶同工酶 同工酶：来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋白结构不同的酶。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶 乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，分别是 LDH 1、LDH 2、LDH 3、LDH 4、LDH 5。 , 生理及临床意义 1.在代谢调节上起着重要的作用。 2.用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征 3.同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断 4.同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。 实验原理--聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 TEMED催化AP生成 硫酸自由基：以AP为催化剂，以TEMED为加速剂。 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： 实验原理--聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶类型： 1.连续系统 ：是指电泳系统采用相同孔径的凝胶.缓冲系统等条件下进行区带电泳,是利用蛋白质分子 的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。 2.不连续系统: 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式,在电泳分离过程中,由于浓缩胶的堆积作用,可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带,对样品进行浓缩,然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离,既存在电荷效应,也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大,但是它具有连续系统不可比拟的优越性,分辨率高。 不连续电泳的四个不连续性 :凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。 蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对LDH进行鉴定,将凝胶浸泡在活性染色液中,LDH与底物的反应,用吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)作为电子的中间载体,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体,底物脱下的氢最后传递给NBT,NBT被还原后,产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。 实验内容 实验内容 1.分离胶制备 实验内容 2.浓缩胶制备 实验内容 3.样品处理：取血清1ml，加入1ml样品缓冲液，混合后供电泳使用。 4.加样：将凝胶管垂直插入电泳槽上，加样（每管50ul，勿弄破胶面），然后在样品液层上小心地加入电泳缓冲液（勿搅动样品层）。 实验内容 5.电泳：凝胶管的上下端分别浸入上下槽缓冲液后，接上电泳，上槽接负极，下槽接正极，开始电泳10分钟内加电流1MA/每管，样品进入分离胶，电流升至2MA/每管，电泳2-4小时，直到溴酚蓝前沿到达距凝胶下端约 0.5 cm时，关闭电源， 停止电泳，取出凝胶管。 6.剥胶：用带长针头的注射器针筒吸满水，然后将针头沿着玻管壁把水推进并旋转玻管，使胶自由滑出。 7.染色：将剥出胶柱浸入染色液中，并在37度水浴中保温至酶带显出，大约5-10分钟。 注意事项 1.封管要严，防止漏液。 2.固定玻璃管要竖直。 3. 凝胶制备时：TEMED和AP要后加，加入后用玻棒缓慢匀速的混匀，避免有气泡产生。 4.配胶后立即灌胶。 * * 根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同,pI各不相同,在同一SDS中,在电场中移动速度不同,可用电泳法将其分离。 Bis将单体长链间连成网状结构： 电荷因素：蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小：蛋白质分子形状和所带电荷和数量相同，分子大小不同 分子形状：蛋白质所带电荷和数量相同，分子形状不同 分离胶的制备 浓缩胶的制备 待分离样品的处理 加样 电泳 染色 分离胶溶液（ml） 蒸馏水 6.2ml 分离胶缓冲液 1.25ml 30%母液 2.5ml TEMED 10%AP 0.03ml 0.1ml 摇匀，混匀，并用蒸馏水封住胶面，静置凝合后，倾去水层，用细条滤纸吸干残余水分。 浓缩胶溶液（ml） 蒸馏水 7.7ml 浓缩胶缓冲液 1.25ml 30%母液 1.0ml TEMED 10%AP 0.03ml 0.1ml 摇匀，混匀，将胶灌在分离胶之上，并用蒸馏水封住胶面，静置凝合后，倾去水层，用细条滤纸吸干残余水分。 *