瑞舒伐他汀对急性脑缺血再灌注损伤TNF-ɑ表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 瑞舒伐他汀对急性脑缺血再灌注损伤TNF-ɑ表达的影响 陈春雷1 李国前2杨小霞2王杰华2潘莹2 　　(1福建省南安市中医院362300） 　　（2福建医科大学附属泉州第一医院362000) 　　【摘要】 目的：观察瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤后肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）表达的影响。方法：大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(model组)和实验组(test组)。线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型，于缺血1h后再灌注12h后断头取脑，免疫组织化学法和半定量PCR法检测大鼠脑组织中TNF-ɑ的表达。结果：与模型组相比，实验组大鼠TNF-ɑ的表达显著下调，差异有统计学意义（P lt;0.05）。结论：瑞舒伐他汀对脑缺血损伤的保护机制可能与抑制炎症因子的表达有关。 　　【关键词】瑞舒伐他汀；脑缺血再灌注；TNF-ɑ表达 　　【中图分类号】R965【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）14-0377-02 　　炎症反应在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中发挥重要作用。在参与炎症反应的众多介质中，肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）具有重要的影响。新近研究表明，降脂药物瑞舒伐他汀具有抗炎、抗氧化、调节免疫、改善血管内皮功能等作用[1]。本研究旨在观察瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-ɑ表达的影响，探讨瑞舒伐他汀的可能抗炎机制。 　　1.材料和方法 　　1.1 实验动物和分组 　　雄性SD大鼠24只，体重250～300g，福建医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK2012-0001）。随机分为3组：假手术组(sham组)、模型组(model组)和实验组(test组)，每组8只。 　　1.2 药品和试剂 　　瑞舒伐他汀，英国阿斯利康制药公司(10mg/片)；兔抗大鼠TNF-ɑ多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；即用型免疫组化试剂盒(鼠/兔)，福州迈新生物技术开发有限公司；Trizol试剂，美国Invitrogen公司；PCR试剂盒及逆转录试剂盒，美国MBI Fermentas公司；引物合成，上海生工生物工程技术公司。 　　1.3 模型制作和给药方法 　　模型组和实验组参考改良Zea-Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。血流阻断1h后拔出线栓，形成再灌注。假手术组大鼠接受相似手术处理，但是不插入线栓。将瑞舒伐他汀片研磨成均匀细小的粉末状，倒入20mL的离心管内，加入适量的生理盐水充分混匀，使药物质量浓度为1g/L。实验组在模型制作前用瑞舒伐他汀5mg/kg/d连续灌胃10d，1次/d；假手术组和模型组正常喂养。 　　1.4 模型处理和取材部位　 　　大鼠于再灌注后12h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰卧固定，迅速开胸暴露心脏。经左心室行主动脉插管，剪开右心耳作为灌注液流出口，在10～20min内经左心室灌注200mL生理盐水快速冲洗，取出全脑，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑半球，弃去左侧大脑半球，取右侧半球，取大鼠视交叉后6～11mm的脑组织备用。 　　1.5 神经功能评分 　　参照Longa的5分法进行评定。大鼠脑缺血/再灌注后清醒时进行神经功能评分：0分：无明显神经功能缺损；1分：不能伸展左侧前肢；2分：行走时向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，0分和4分者均被剔除，同时按要求及时补充大鼠入组。 　　1.6 免疫组织化学法检测TNF-ɑ的表达 　　大鼠脑组织切片经脱腊至水，严格按照试剂盒说明书操作，AEC室温显色，自来水冲洗，苏木素复染，水性封片剂封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性细胞计数：在400倍光学显微镜下分别随机选取5个视野，分别计数免疫反应阳性的细胞数，结果取5个视野的平均值。 　　1.7 半定量PCR法检测TNF-ɑ mRNA的表达　 　　TNF-ɑ上游引物序列：5-ccagaccctcacactcagatca-3，下游引物序列：5-ggaggctgactttctcctggta-3 （扩增产物大小290bp）；beta;-actin上游引物序列：5-attgtaaccaactgggacg-3，下游引物序列：5-tctccagggaggaagagg-3（扩增产物大小490 bp）。取大鼠脑组织按Trizol法提取总RNA并进行逆转录反应。PCR扩增反应条件为：变性940C 30s，退火640C 30s，延伸720C 30s，反应循环数为34。反应完毕后扩增产物进行电泳，半定量分析电泳条带的吸光度，结果以目的基因与beta;-actin吸光度的比值表示。