肠激酶在毕赤酵母中的表达研究.pdfVIP

用啤酒酵母吸附工业废水中重金属离子流程，还没有应用于工业生产。本工艺是 一种设想，采用三级间接吸附，是为了节省酵母，同时增加重金属的积累。采用焚烧 法，是因为啤酒废酵母来源广、价格低。采用稻壳等有机物做助滤剂是为便于焚烧回 收重金属。 作者简介：刘振扬，副教授，主要从事食品发酵专业教学与科研工作。 肠激酶在毕赤酵母中的表达木 宋晓彤黄鹤 (天津大学化工学院生物工程系 天津300072) 因工程目标蛋白表达纯化策略中，许多原核表达载体可以使目标蛋白序列紧接肠激酶 目标蛋白)表达。继而，利用标签蛋白的特点对表达的融合蛋白进行分离纯化，利用 肠激酶的特点将纯化的融合蛋白进行切割，切出的目标蛋白首位氨基酸同天然蛋白完 全相同。因此，EK是基因工程目标蛋白融合表达中的首选工具酶之一。由牛十二指肠 分离的肠激酶两个亚单位分子量分别为重链(115000)和轻链(35000)，轻链是全酶 的催化活性中心，具有全酶的催化活性，所以对于肠激酶的基因克隆，人们一般只选 择克隆它的轻链(EKL)。 本实验利用大肠杆菌E．coliJMl 公司产品)，pET32a／EKL(本实验室前期工作)，酵母细胞GSl15及酵母表达载体pPIC9 (Invitrogen公司PichiaExpessionSystem试剂盒所含产品)，将肠激酶的轻链 基因转到毕赤酵母细胞中，进行发酵从而生产出肠激酶蛋白。 R．La 首先本实验根据Edward accession L19663)的CDS区域，设计PCR引物一对： 7 7一GAACTCGAGAAAAGAATTGTCGGAGGAAG一3 —匕游弓I物：5 7 下游引物：57一GGGG从TTCT从TGTAGAA从CTTTG一3 ·天津市自然科学基金资助资项目(项目编号06YFJMJCl3200) R4 此引物是为毕赤酵母分泌型表达设计，以pET32a／EKL质粒为模板，PCR扩增获得 EKL的基因片段，纯化后的目的片段与pUCm-T载体连接过夜、转化，筛选阳性克隆， 经Xho I和＆DRI酶切后的重组质粒有约714bps的DNA片段出现，与预期一致；而以空 pUCm-T质粒进行酶切作为阴性对照则只见一条约2．8kb的大片段，得到重组克隆载体 pUCm—T／EKL。 I、眈oR 再将pPIC9质粒载体和pUCm—T／EKL分别进行XhoI双酶切，37℃温育2d, 时，l％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化pPIC9质粒DNA大片段和目的基因EKLdx片段，估算 目的基因与载体的浓度后，连接过夜、转化，筛选阳性克隆。对重组穿梭质粒pPIC9／EKL 的酶切鉴定：经XhoI和DRI酶切后的重组质粒有约714bps的DNA片段出现，以空 pPIC9质粒进行酶切作为阴影对照则只见一条约8kb的大片段。由此可初步确定重组质 粒有目的片段的插入。 pPIC9／EKL转化毕赤酵母细胞，得到重组酵母细胞。以前述转化子细胞基因组DNA 型。然后对重组酵母细胞摇培发酵，加入甲醇诱导其蛋白质表达，对表达产物做SDS— 在相应位置无条带，其他位置条带均与前者完全相同，为毕赤酵母GSl15分泌型表达 的固有蛋白。SDS—PAGE凝胶图片上的蛋白质条带经光密度扫描、计算，求得重组蛋白 约占培养基上清总蛋白的32．8％。 最后将得到培养物破碎收集发酵上清液，用0．22pin膜过滤后，超滤浓缩待用。 将预处理过的STI—Sepharose4B介质加入盛有原料液的三角瓶中，在摇床上缓慢摇 动，待目标蛋白吸附完全后，将混合物倒回自制一次性柱中。充分洗脱后，收集洗 脱液，即获得纯化的重组蛋白。SDS鉴定洗脱收集液及重组蛋白的定量估算：STI 层析纯化产物在大小约36kDa处有一蛋白条带，其位置与诱导表达的上清中深染条带 一致。经软件分析，层析纯化产物纯度均在95％以上。洗脱蛋白浓度0．192mg／ml，则 每毫升培养液可rEKL=O．