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第三章 基因工程的酶学基础  第三章  基因工程的酶学基础  第一节  限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease）   一、限制性核酸内切酶的发现        早在五十年代初，两个研究小组几乎同时发现了两种不同来源的l噬菌体（lK和lB）能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞（K株和B株），但当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，则感染频率普遍下降数千倍。一旦lK噬菌体在B株中感染成功，由B株繁殖出的lK后代在第二轮接种中便能象lB一样高频感染B株，但却不再有效地感染它原来的宿主K株。这种现象称为宿主细胞的限制和修饰作用，它广泛存在于原核细菌中。        1960s，Linn和Arber在研究细胞限制性和修饰现象时在大肠杆菌中发现了限制性内切酶，人们才搞清了细菌限制和修饰作用的分子机制。大肠杆菌K株和B株都含有各自不同的限制-修饰系统，它们均有三个连续的基因位点控制，其中hsdR编码限制性核酸内切酶，它能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断；hsdM的编码产物是DNA甲基化酶，催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应；而hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。lK和lB长期分别寄生在大肠杆菌的K株和B株中，宿主细胞内甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性内切酶的特异性降解，由于这种降解作用的不完全性，总有极少数入侵的DNA分子幸免于难，它们得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但丧失了在其原来宿主细胞中的存活力，因它们在接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。大肠杆菌C株不能产生限制性内切酶，因而其它来源的l噬菌体可以感染C株，而在C株中繁殖的l噬菌体则在K株和B株中受到严格的限制作用，细菌正是利用限制修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。  二、限制性内切酶的类型        目前，在细菌中已发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类：I 型限制性内切酶、II 类限制性内切酶和III类限制性内切酶。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA重组。I类和III类酶严格地说应该称为限制-修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。  三、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）的性质和功能特点 限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物细胞内，它们是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4 - 8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶（内切酶即在核酸分子链的内部制造切口的酶）。功能为自我保护作用。 细菌的限制和修饰系统（R-M体系）：几乎所有的限制性内切酶都和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用，从而构成限制修饰系统（restriction-modification system）。R-M系统消化外来DNA，但自身的DNA因被甲基化受到保护。 （1）限制（Restriction）：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 （2）修饰（Modification）；细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。细菌细胞内有两种甲基化酶：① Dam甲基化酶，在GATC腺嘌呤N6位置引入甲基；② Dcm甲基化酶。在CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基.  四、I和III类限制-修饰酶的基本特征        I型限制性内切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。I类限制-修饰酶的种类较少，研究较多的是大肠杆菌的EcoK和EcoB，它们均为异源多聚体，其亚基R、M和S分别具有限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异性位点识别的活性。 （1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列，非对称性。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC （2）切割位点；在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。 （3）作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。        I类酶与其DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱