微生物学检验细菌的培养与分离技术.ppt

细菌的培养与分离技术 培养基 常用玻璃器材的准备 培养基的成分和作用 培养基的种类 培养基的制备 常用玻璃器材的准备 玻璃器材的种类及用途 玻璃器材的清洗 ★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水清洗 ★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 ★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－→洗涤剂洗刷－→清水冲洗 ★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤 ★含油脂的器皿：单独灭菌 玻璃器皿灭菌前的准备 玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。 培养基的成分和作用 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂 培养基的种类（按用途分类） 基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA） 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 厌氧培养基：用于培养厌氧菌 培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。 培养基制备的一般程序 培养基pH测定及矫正 材料： 待测培养基、 pH7.4标准比色管、4孔比色架、0.02％酚红、 氢氧化钠0.1mol/L、1mol/L） 盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 蒸馏水 试管（与比色管口径一致）、 刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、 pH矫正 pH矫正 计 算 假设2ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol/L NaOH 0.12ml，现有培养基1000ml，求需加NaOH的量。 细菌的接种与培养 无菌技术 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 标本的采集 无菌试管、烧瓶的使用 细菌接种的基本程序 细菌接种法 平板划线接种法： ★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 ★方法： ★分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★连续划线法：适用于含菌量较少的标本 液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数 分区划线法 连续划线法 细菌培养法 一般培养（需氧培养）： ★培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ★培养时间：18～24h 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等 细菌在固体培养基中的生长现象 菌落 ★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 ★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 ★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。 细菌在液体培养基中的生长现象 混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌 细菌在半固体培养基中的生长现象 有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。 菌 落 菌落与菌苔 细菌在液体培养基中的生长现象 细菌在半固体培养基中的生长现象 常用细菌生化反应试验 糖醇类代谢试验 糖发酵试验 甲基红试验 V-P试验 葡萄糖氧化／发酵试验（O/F试验） 七叶苷水解试验 Β－半乳糖苷渗透酶试验 糖发酵试验 原理 多糖－→单糖－→丙酮酸－→酸性产物(或产酸产气)－→pH↓ －→指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现) 培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管 试剂：酚红、溴甲酚紫等 结果:培养基呈酸性变色 应用：观察细菌对糖度的 分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定 甲基红试验 原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。 培养基：葡萄糖蛋白胨水 试剂：甲基红试剂 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： － 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌 伏－普试验（V-P试验） 原理