RNA干扰HIF-1α对肝癌细胞系HepG2生物学特性的影响.docVIP

精品论文 参考文献 RNA干扰HIF-1α对肝癌细胞系HepG2生物学特性的影响 周焕城 彭广福 宋越 张彩云 温治强 徐继威 温苑章 李嘉 （梅州市人民医院普外科 514000） 【摘要】 目的 缺氧诱导因子-1 alpha; (HIF-1 alpha;)是参与肿瘤细胞代谢的核心转录因子。本研究旨在于评估RNAi下调HIF-1a对肝癌细胞系HepG2生物学特性的影响。方法 化学合成特异性HIF-1a siRNA，转染缺氧条件下培养的肝细胞肝癌细胞系HepG2，利用Westernblot技术检测转染后HIF-1a，血管生产因子，和基质金属蛋白酶2表达情况。MTT分析及裸鼠皮下接种肿瘤细胞明确细胞增殖率。结果 乏氧条件培养，HIF-1alpha;表达减少61.54%，VEGF表达减少64.71%；MMP-2表达减少53.33%。HepG2 细胞增殖力下降50%，接种裸鼠肿瘤形成缓慢。结论 HIF-1a SiRNA抑制HIF-1alpha;表达，抑制肝癌细胞系生长。其机制可能与下调血管生成因子和基质金属蛋白酶表达有关。 【关键词】 缺氧诱导因子-1 alpha; RNA干扰 肝细胞肝癌 【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）15-0078-03 前言 肝细胞肝癌是危害人类健康的第五大恶性肿瘤，每年大约500,000新发病例，肿瘤致死率位居第三位[1-2]。血管丰富是影响肝癌预后的主要原因，在肿瘤生长和转移过程起重要作用。低氧是实体瘤微环境的基本特征之一，局部缺氧微环境使肿瘤细胞的一些基因和蛋白表达发生改变。这些变化使肿瘤细胞在适应缺氧微环境的同时，也会增加肿瘤血管生成。在这个过程中转录因子HlF-l起着中枢纽带的作用[3]。 缺氧诱导因子是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体的一种转录因子[4,5]。研究证实HIF—l在动物及人体许多肿瘤中大量表达，对肿瘤的生长、血管生成、转移、凋亡及耐药皆有影响。HIF-1alpha;与HIF-1beta;结合形成有转录活性的HIF-alpha;，从而调节血管生成，肿瘤生长和凋亡等活动。常氧情况下，HIF-1alpha;维持低浓度状态。缺氧状态下，更多的HIF-1alpha;与HRE结合，刺激血管生成，在肿瘤细胞浸润、转移方面起重要作用。本研究旨在评估是否特异性的HIF-1a siRNA对肝癌细胞系HepG2的增殖有明显抑制作用，初步探索其机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂 实验使用BALB/c裸小鼠12只，雄性，体重16～18g，北京维通利华有限责任公司提供。HepG2来源于ATCC。DMEM培养基由Gibco公司提供；转染试剂（Lipofectmine 2000）及转染专用培养基（Optimedian）购自 Invitrogen公司；MTT增殖试剂盒购自美国Roche公司；胎牛血清由杭州四季青公司提供；HIF-1alpha;抗体购自美国BD bioscience公司；VEGF和MMP-2抗体均购自Invitrogen公司；beta;-actin及羊抗鼠二抗均由Santacruz公司提供。酶联免疫检测仪为美国Thermo Electron公司产品。 1.2 实验方法和步骤 1.2.1 siRNA的合成 HIF-1alpha;基因(NM-001530)，Ambion网站在线设计合成2对人HIF-1a siRNA，预实验选出最有效的一对用于本实验。HIF-1a siRNA双链长度为19bp，序列为：正义链(5-3)AUCCAGAGUCACUGGAACU；反义链(3-5) UAGGUCUCAGUGACCUUGA。同时选取一对与人HIF-1a基因序列完全没有同源性的siRNA寡核苷酸序列作为阴性对照，均送上海生工公司合成。 1.2.2 siRNA转染HepG2细胞 细胞培养包括细胞复苏、细胞计数、活力测定和细胞冻存等。HepG2于含10% 胎牛血清的DMEM培养基，37deg;C、5% CO2 条件下培养。细胞种于24孔板，80% 融合时进行转染实验。按操作步骤用Lipofectamine 2000进行转染，荧光标记对照siRNA观察转染效率达80%以上。 1.2.3 免疫印迹分析 siRNA转染后24h裂解细胞，SDS电泳分离，半干电转法将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶粉封闭，HIF-1alpha;鼠抗人抗体 (1:500稀释), 血管