质粒DNA的提取及电泳检测.pptVIP

DNA的琼脂糖凝胶电泳 1.原理： DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 2. 琼脂糖凝胶分离DNA的范围 DNA的琼脂糖凝胶电泳 3.DNA染料 A:EB 溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB）可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。 B：新型低毒染料： 如Gold View、SYBR?GreenⅠ、SYBR?Gold等。 毒性较低，但价格较昂贵。 灵敏度较好，但不如EB。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 4.琼脂糖胶液制备（1%，50 ml） 4.1 称取0.4 g琼脂糖，置于200 ml锥形瓶中，加入40 ml 0.5×TAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶解。一般需反复煮沸3次，琼脂糖才能充分溶解。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发； 4.2 待胶液冷却至60℃左右时，加入5%的Gold View染料，混匀，既成琼脂糖胶液。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 5.凝胶板的制备 5.1 将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入胶槽中，使凝胶厚度约为0.3-0.5 cm，赶走气泡后迅速插上梳子，让胶凝固。 5.2 待凝胶完全凝固后（约20~30 min），小心从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，让液面高出胶面1 mm左右。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 6.加样 取待检测样本适量，按照5份上样液搭配1份 6×DNA Loading Buffer的比例混匀（注意不要产生气泡），用微量移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 7.电泳 加完样后立即接通电源。控制电压小于8 V/cm，电流在100 mA以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶2/3时，停止电泳。 8.成像 在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。保存图像。 质粒DNA提取——电泳检测 琼脂糖凝胶电泳检测 * * * * * * 核酸提取原理及方法 遵义医学院珠海校区生物化学与分子生物学教研室 前言 　　　核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 主要内容 核酸简介 质粒DNA提取 PCR扩增目的基因 琼脂糖凝胶电泳 核酸简介 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′- 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。 DNA主要储存遗传信息。 核酸简介 如何分离DNA？ 核酸简介——质粒DNA 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。 质粒DNA提取 质粒DNA提取的方法： 碱裂解法 煮沸法 质粒DNA提取——碱裂解法原理 质粒DNA提取及检测——实验准备 1.实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。 2.实验耗材 无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。 3.实验试剂 LB培养基、抗生素、琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。 4.实验材料 对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α） 质粒DNA提取——碱裂解法 碱裂解法试剂配方 　 组分1 　组分2 Ⅰ液 25 mM Tris-HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA（pH 8.0 ） Ⅱ 液 0.2 M NaOH 1% SDS Ⅲ 液 3 M KAc （pH 4.2） RNase A 1