第十二章 09 DNA的生物合成.pptVIP

第十三章 DNA的生物合成 遗传信息传递的中心法则 目 录 第一节 DNA的半保留复制 DNA的半保留复制的概念 DNA的半保留复制实验依据 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验) 二、DNA聚合反应有关的酶类及条件 底物 模板 拓扑异构酶 解旋酶 单链DNA结合蛋白 引发酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA复制以四种脱氧核糖核苷酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。 ? (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 聚合反应机理 DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。 亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。 拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶。在复制时，随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。 拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。 有Ⅰ和Ⅱ两种类型 首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。 另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。 由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。 两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。 要将DNA双链解开，主要依赖于DNA解旋酶（也称为解链酶），还需要参与起始反应的多种蛋白因子，如DnaA。 DnaA能够识别大肠杆菌复制原点OriC富含A/T的3个13个bp的重复序列区，使双链DNA连续变性，启动解链过程。 （五）单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋降稳蛋白（HDP）。能够与单链DNA结合的蛋白质因子，其作用为： ① 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；防止DNA链重新结合。 ② 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。 分子量约为60kDa的单肽链，每个细胞约有50-100个分子，该酶单独存在时活性低，只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活性，这种复合体称为引发体（primosome）。 引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3‘-OH，使子代DNA链能够开始聚合。 合成的引物是长约5-100个核苷酸的RNA。一旦RNA引物合成，就可以由DNA聚合酶Ⅲ在它的3′-OH上继续催化DNA新链的合成。 DNA聚合酶是以DNA为模板，催化底物（dNTP）合成DNA的酶类，普遍存在于生物体内。它们的作用方式基本相同，都需要dNTP、Mg2+、模板DNA和引物，在DNA模板指导下，催化底物加到引物的3′-OH上，形成3′，5′—磷酸二酯键，由5′→3′方向延长DNA链。引物是DNA合成所必需的。 在大肠杆菌中，目前发现的DNA聚合酶 （DNA polymerase）有三种： DNA聚合酶Ⅰ（pol Ⅰ） DNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ） DNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ） 这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol Ⅲ和pol Ⅰ。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ由一条分子量为101kDa的单一多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。每个大肠杆菌细胞约有400个分子的DNA聚合酶Ⅰ。  Arthur Kornberg于1957年分离出来，因此获得1959年的诺贝尔奖。 分离工作十分艰巨，用了100kg细菌分离到500mg的纯酶（polymerase Ⅰ），或称Kornberg酶。它是一个多功能酶。 DNA聚合酶Ⅰ的功能如下： ①5′→3′聚合酶活性，即当底物和模板存在时，DNA聚合酶Ⅰ可使脱氧核糖核苷酸逐个加到引物的3′-OH末端的多核苷酸链上，在37℃条件下，每分子DNA聚合酶Ⅰ每分钟可以催化大约1000个脱氧核苷酸的聚合； ②5′→3′外切酶活性，它可以及时切除复制起始合成的RNA引物； ③3′→5′外切酶活性，起校对功能