生物化学实验-血清蛋白质电泳.pptVIP

1．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06） 称取巴比妥钠12.36g、巴比妥2.21g，于500ml蒸馏水中加热溶解，冷却至室温后，用蒸馏水定容至1L。2．染色液（1）丽春红S染色液：称取丽春红S 0.4g、三氯醋酸6g，溶于蒸馏水中并定容至100ml。（2）氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.1g，溶于20ml无水乙醇中，加冰醋酸5ml，甘油0.5ml；另取磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，混和摇匀，再以蒸馏水补足至100ml。3．漂洗液（1）3%（V/V）醋酸溶液：适用于丽春红S染色的漂洗。（2）甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。4．透明液（1）液体石蜡或氢萘的润湿透明法，均十分方便。（2）冰醋酸∶95%乙醇=2.7∶7.5的混合液。（3）N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸（3.03mol/L N-甲基-2-吡咯烷酮，0.15mol/L柠檬酸）：称取柠檬酸15g溶于150ml水中，加入N-甲基-2-吡咯烷酮150ml，混匀，加蒸馏水至500ml。 5．洗脱液 （1）0.1mol/L NaOH溶液：适用于丽春红S染色的洗脱。（2）0.4mol/L NaOH溶液：适用于氨基黑10B染色的洗脱。6．电泳仪 电子管或晶体管整流的直流电源，电压0～600V，电流0～300mA。7．电泳槽 铂（白金）丝电极的水平电泳槽。8．加样器 Hb管和0.2cm×1.5cm有机玻璃片或X线胶片或特制电泳加样器。9．染色皿、漂洗皿、无齿镊子。10．光密度计、721分光光度计。11．醋酸纤维素薄膜 规格2cm×8cm（比色法），6cm×8cm（扫描法）。 1．准备（1）电泳槽：电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架距离约2～2.5cm，支架宽度调节在5.5～6cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥。（2）CAM的准备：选择厚薄一致，透水性能好的CAM，在无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线作点样标记。然后将CAM无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓冲液的平皿中，使之自然浸湿下沉，待充分浸透后（约20min）用镊子取出。2．点样（1）将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去CAM上多余的缓冲液。（2）用血红蛋白吸管取待测新鲜血清3～5μl，均匀涂布于点样用的有机玻璃片或X线胶片上，或用加样器蘸少许血清，垂直印在CAM无光滑面划线处，待血清完全渗入薄膜后移开。 3．电泳（1）将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用滤纸或纱布将膜的两端与缓冲液连通，平衡5min。（2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极连接，打开电源，调电压为8～15V/cm膜长或电流0.3～0.5mA/cm膜宽。夏季通电45min，冬季通电60min。待电泳区带展开约3.5～4.0cm，即可关闭电源。4．染色 用镊子取出薄膜条直接投入丽春红S或氨基黑10B染色液中染色5～10min。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。薄膜条较多时，应避免彼此紧贴致染色不良。 5．漂洗 准备3～4个漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景无色为止。 6．定量（1）洗脱比色法①氨基黑10B染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，在Alb管内加入0.4mol/L NaOH溶液6ml（计算时吸光度乘2），其余各管加入3ml，于37℃水浴20min，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却。用620nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。②丽春红S染色法：用0.1mol/L NaOH溶液脱色，加入量同上，10min后，向Alb管中加入40%（V/V）醋酸0.6ml（计算时吸光度乘2），其余各管加0.3ml，以中和部分NaOH，使色泽加深。用520nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。（2） 光密度计扫描法①透明：不保留的电泳图可用液体石蜡或氢萘浸透后，取出夹在两块优质的薄玻璃间，供扫描用；如要保留的电泳结果的薄膜可用冰醋酸乙醇法或N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸法透明。将薄膜放入透明液中2～3min（延长一些时间亦无碍），然后取出，以滚动方式平贴于洁净无划痕的载玻璃片上（勿产生气泡），将此玻片竖立片刻，除去一定的透明液后，于70～80℃（N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸法透明，90～100℃）烘烤15～20min，取出冷却至室温，即可透明。②扫描定量：将已透明的薄膜置光密度计的暗箱内，选择波长520nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对百分含量。 【计算】 AX表示