第五讲-酶的分子改造-2011.pptVIP

酶的分子改造 —获得具有优良性质的生物催化剂 新酶催化剂的获得途径 新酶筛选 可培养微生物酶的筛选：富集、驯化 不可培养微生物酶的筛选：宏基因组 基因数据库挖掘 现有酶的分子改造 理性设计 (Rational design)：在深入了解酶的结构、功能和催化机制等信息的基础上，对酶的突变位点进行精确设计，采用基因工程手段对天然酶的序列进行改造，获得具有所需性能的新酶 定向进化 (Directed evolution)：通过随机突变、DNA重组等手段对酶的基因序列进行改造，并对获得的突变酶库进行定向筛选获得性能优异的突变酶 酶蛋白的理性设计改造 酶的理性设计改造步骤 分子模建：根据已知的目标酶一级结构序列，构建蛋白质的分子图像 理性设计突变位点：通过对酶结构与性能之间的关系的理性分析，确定需突变的氨基酸残基 酶的突变与表达： 通过基因工程手段，对酶基因DNA进行定点突变 选择合适的表达载体与宿主，对突变酶进行高效表达 对突变酶的性质进行分析，指导新一轮理性设计 酶的理性设计改造 —分子建模 序列分析： 基因测序确定目标酶的一级结构，从公共酶数据库有哪些信誉好的足球投注网站相关序列，用免费的ClustalW程序或服务器做多重序列联配 公共酶数据库：http://www.brenda.uni-koeln.de ClustalW 服务器：/software/ClustalW.html 分子模建：以已知的同源蛋白质结构为模板对目标酶进行同源模建 Swissmodel同源模建服务器： 分子图像：模建成功，服务器会E.mail返回PDB文件，可用Rasmol或 PDBviewer等免费软件进行演示分析 在已知DNA序列中取代特定的核苷酸，从而改变酶结构中特定的氨基酸残基；或对一段最可能影响酶功能与性质的基因序列进行随机突变，可以表达产生一个或一系列突变酶分子。 寡核苷酸引物介导的PCR定点突变法 盒式突变法 DNA全合成法 寡核苷酸引物介导的PCR定点突变法 盒式突变法(cassette mutagenesis) 盒式突变法，又称片段置换法(DNA fragment replacement)，是1985年Wells提出的 利用目标基因的适当限制性内切酶位点，用任意长度和序列的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列 通过盒式突变可以对特定位点的氨基酸残基进行饱和突变；也可以用来产生嵌合蛋白质，将蛋白质分子中的整个结构域用完全不同的氨基酸序列来置换 通过盒式突变可以产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标酶的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段的功能提供了一个切实可行的方法 DNA全合成法 理性设计 改造实例 理性设计改造的优势及其局限性 目标明确，工作量较小 目前，研究确定了影响酶稳定性(热稳定性、pH稳定性、有机溶剂耐受性等性质)的许多结构特征，理性设计在改善酶稳定性方面具有较高的成功可能性 对其它基本性质(如活性、底物特异性、对映选择性)和结构之间的关系的理解还非常不充分，其结构影响参数难以清楚地界定，成功范例较少 有理设计改造将来的进步主要依赖酶结构-功能方面的重大认识突破，其次在于结构生物学方面结构鉴定的进展，和生物信息学方面模建程序的完善 酶蛋白的定向进化改造 蛋白质定向进化概念的提出 1993年，美国科学家Arnold FH首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。 酶的定向进化 人为创造特殊的条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变；从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为改造的)出发，经过基因的突变和重组，构建人工突变酶库，采用高效的筛选或选择方法，最终获得具有某些优良特性的进化酶 定向进化=随机突变/正向重组+定向选择/筛选 生物催化剂的定向进化 突变酶基因库的建立 易错PCR (Error prone PCR) DNA改组 (DNA Shuffling) 随机引发重组 (Random-priming recombination) 交错延伸 (Stagger extension process) 易错PCR 在PCR扩增目的基因的同时引入碱基错配，获得随机突变基因片段 调整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离子，改变体系中四种dNTP的浓度等，即可调节基因扩增的突变频率 使用Mn2+代替Mg2+作为DNA合成酶的激活剂使碱基配对错误率提高，0.1~2 ?10-4 (标准条件) ? 7 ? 10-3 通常控制每个基因2-5碱基替代的平均突变水平，对