高效液相色谱法测定食品中的叶酸.docxVIP

科研经验高效液相色谱法测定食品中的叶酸任一平1张爱珍2朱黎炎2黄百芬1铁晓威11 (浙江省疾病预防控制中心 , 杭州 ,310009) 2 (浙江大学医学院 ,杭州 ,310009)摘 要 在食品样品中加入体积分数 60 %高氯酸溶液去蛋白 ,过滤后进样检测叶酸 。流动相选用p H 3 . 5 ,体积分数 12 %的乙腈 ,浓度 50 mmol/ L 的 KH2 PO4 溶液 。流速为 1 mL / min ,经 ODS C 18柱 分离 (柱温为 40 ℃) ,用质量分数 0 . 5 %的过二硫酸钾溶液作柱后衍生剂 ,流速为 0 . 3 mL / min ,柱后反应温度为 60 ℃,经荧光检测器 ( Ex : 365 nm , Em : 450 nm) 检测定量 。实验结果表明 , 在 0101 ～312μg/ mL 的浓度范围内 ,线性良好 ,相关系数为 0 . 9999 ;最低检出浓度为 0 . 01μg/ mL ; 方法回收 率为 98 . 1 % ;变异系数为 213 % 。关键词 柱后衍生 , 过二硫酸钾 , 叶酸叶酸是一种重要的 B 族维生素 ,是体内生化反应中一碳单位转移酶系的辅酶 ,起一 碳单位传递体的作用 ,与许多重要的生化过程密切相关 。叶酸缺乏会引起巨幼红细胞贫 血 、高同型半胱氨酸血症 ,后者被认为是心血管疾病的独立危险因素 。孕妇缺乏叶酸是引 起胎儿神经管畸形的主要原因 ,且会出现先兆子痫 ,胎盘早剥发生率增高 。许多研究证 实了叶酸与新生儿缺陷 、成年与老年心血管 病 、精神科疾病 、胃肠功能异常 、免疫学缺陷及肿瘤等具有相关性 。叶酸广泛存在于各种动植物食品中 ,但 天然食物所含叶酸大部分以多谷氨酸叶酸的 形式存在 ,且含量不高 。美国 1998 年 1 月 1 日起已强制规定在某些谷物 食 品 中 强 化 叶 酸 ,FDA 规 定 1 000 g 谷 物 食 品 ( 如 面 包 、面 粉 、早餐谷物 、大米等) 强化 1 . 4 mg 叶酸1 。 我国已在婴幼儿 、老年食品中强化叶酸 。但 由于缺少快速的检测方法 ,因而一般实验室 还未开展叶酸含量的测定 。因此 ,建立简单 、 快速 、准确的测定各种食物尤其是婴幼儿 、孕 妇强化食品及老年食品中的叶酸含量有重要 的现实意义 。目前用于叶酸含量的测定方法有 : 微生 物法 ,放射免疫法 , 气相2质谱联用法等 。国外 20 世纪 70 年 代 提 出 叶 酸 的 色 谱 分 析 方法 ,包括高效 离 子 交 换 层 析 、离 子 对 分 配 层 析 、高效液相色谱方法等 ,这类方法可以进行1 种或几种叶酸类物质的分析检测 , 实现叶 酸不同成分的分离 ,因此发展较快 。色谱法 在叶酸分析中得到日益广泛的应用 ,尤其是 高效液相法 。1991 年 Hahn 等提出了对本身 无荧光的叶酸在强氧化剂如过二硫酸钾等的作用下可以产生荧光 ,从而用荧光检测器检 测分析 。在其他研究中 ,对叶酸的检测仍以 紫外为主 ,波长范围在 250～310 nm 之间 ,样 品包括了猪 血 浆 血 清 、乳 制 品 、小 鼠 的 红 细胞6以及经叶酸强化的谷物等 。 Kelly 等用高效液相结合微生物法检测叶酸 ,发现方法可行 ,而且适用于人体叶酸摄入后的血清叶 酸水平的连续监测 。随着毛细管电泳法的发 展 ,其在叶酸分析中的作用也逐渐被人们重 视 ,但目前应用不多 。文中用高效液相柱后衍生法建立一个适用于天然或强化食品中叶 酸定量检测的快速 、简便 、准确的方法 。试剂与仪器11 . 1试剂乙 腈 , HPL C 级 ; KH2 PO4 , A R 级 ; H3 PO4 ,A R 级 ; 氨水 ,A R 级 ; 叶酸标准品 ,生第一作者 :大学毕业 ,教授级高工 。收稿时间 :2003 - 04 - 15 ,改回时间 :2003 - 10 - 1746生产与科研经验第 29 卷 第 10 期任一平等 :高效液相色谱法测定食品中的叶酸化试剂 ( 购自 Sigma 公司) ; 过二硫酸钾 , A R级 ;高氯酸 ,A R 级 ;质量分数 0 . 5 %过二硫酸 钾溶液 ,称取过二硫酸钾 2 . 5 g ,加水溶解并 定容至 500 mL ,用 0 . 45μm 的滤膜过滤 ; 体 积分数 50 %氨水 ,吸取氨水 50 mL ,加水稀释 至 100 mL ; 体 积 分 数 60 %高 氯 酸 , 量 取 60mL 氯酸 ,加水溶解并稀释至 100 mL ;体积分 数 50 %磷酸 , 吸取磷酸 50 mL , 加水稀 释 至100 mL ;50 m mol/ L 的 KH2 PO4 溶液 (p H =3 . 5 ) , 称 取 KH2 PO