多功能木霉菌分子改良与功能分析.pdfVIP

第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会 多功能木霉菌分子改良与功能分析★ 陈捷，周晓瑛，刘力行，徐书法 (上海交通大学农业与生物学院上海201101) 摘要：本研究从木霉菌REMI突变株中筛选到15株对氰化物具有明显的降解活性，共中7株转化子对黄瓜幼苗枯 系活性的提高。转化子F3发酵液表现出对黄瓜白粉病有明显的诱导抗性作用。转化子J9发酵液对水田稗草生长表 对照的3。21和4．25倍。因此通过分子改良木霉菌可获得多种功能。 关键词：REMI突变株；生物修复；氰化物；生物防治；诱导抗性 木霉菌(Yrichoderma spp．)是国际应用非常普遍的植物病害生物防治菌，然而近年来人们发 现木霉菌不仅具有防治病害的价值，同时还能降解农田土壤和水域氰化物污染、防除杂草的功能， 氰化物的氰水合酶(cyanide Harman等…也发现目前普 hydratase)和硫氰酸酶(rhodanese)。Gary 遍使用的植物生物防治木霉菌可在氰化物污染的土壤中可以生长，并与柳树根形成治理氰化物污染 的共生体系。因此筛选获得具有修复氰化物污染，同时保持生物防治功能的木霉菌株是完全可能的。 本研究利用REMI(限制性内切酶介导的基因整合)技术，创造木霉菌突变株，从中筛选具有降解氰 化物活性明显高于出发菌株的转化子，同时又能对枯萎病、白粉病和水田杂草有明显的抑制作用， 从而实现木霉的多功能性。 1材料与方法 1．1供试菌株与品种 harzianumstrain atroviridestrain T21)菌株 木霉菌：T23(TrichodermaT23)和T21(Trichoderma 孢子于无菌水中，稀释至107个孢子．mL．1。 病原菌：黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum solani，简称为RS)，莴苣菌核 oxysporumf．sp．melon，简称为FOM)，立枯丝核菌(Rhizoctonia 病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib．)deBary，简称为SSB)，灰霉病(Botrytis 瓜白粉病菌(Sphaerothecafuliginea)。 1．2原生质体制备 参照经修改的Sandhu等(1989)旧1制备原生质体方法。孢子悬浮液1mL加入到lOOmL液体菌丝 向离心管加入菌丝重2倍重量的L1412和崩溃酶(Sigma)(浓度为13 (130 1．3质粒提取 长期的细菌培养液于1．5mL微量离心管中，5000 (50mmol·L1葡萄糖，lOmmol·L～EDTA，25m 上海交通大学农科基金。 作者：陈捷，教授，博士生导师，主要从事生态农业研究。E-mail：jiechen59@sjtu．edu．an 第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会 新按上述步骤抽提、沉淀经酶消化的DNA，一20℃下保存。 1．4转化 质粒40№、限制性内切酶HindⅢIOBL(10个单位·儿1)、STC200儿，配制成酶一质粒混合 液，置冰浴上备用。100pL原生质体悬浮液与一定量酶一质粒混合液，混匀后，置冰上一定时间。缓 慢加入2mLPEG。弃上清液，加2mLLR培养基悬浮沉淀。将培养液倒入再生培养基，然后用含250—300 腿·mLl潮霉素的培养基反复筛选化子。将转化子转移到斜面上培养后，于4C冰箱中保存。 1．5木霉菌转化子PCR检测 引物的设计：根据抗潮霉素基因序列设计引物5’ 7 一GTGTCGCCCTTATTCCCT一3 5’