H9N2亚型禽流感病毒传播途径特性的比较和其表面基因序列的测定和分析.pdfVIP

家禽传染病 H9N2亚型禽流感病毒传播途径特性的比较和其表面基因序列的测定 和分析 石火英陈素娟高崧刘武杰刘秀梵+ (扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病学重点开放实验宣扬州 225009) influenza 摘要：选择中国大陆最早分离的H9N2亚型禽流感病毒(avianvirus，AIV) 特性作了系统的比较，发现F株在4周龄SPF鸡气管中的复制能力高于ss株，F株可以经气溶胶传播途 株的NA基因在63．65位存在氨基酸缺失。 关键词：H9N2亚型AIV；F株；ss株；传播途径；HA和NA基因；序列 生，未造成严重后果。但是1998年始发于河北省地区的H9亚型禽流感来势凶猛，在几个月的时间内即扩 展到包括我国主要养禽地区的20多个省、市、自治区，造成了巨大损失。其原因可能是1998年的毒株获 得了一些有利于在鸡群中迅速传播的特性“；J。A型流感病毒的致病性是由多因素决定的，HA和NA基因 是流感病毒的2个表面糖蛋白基因，是病毒致病性的主要决定凶素。鉴于我国H9N2亚型禽流感流行的特 点，有必要对我国最早分离的和形成大流行时期的H9N2亚型AIV的传播途径特性方面的差异作出详细的 研究对象，对其在SPF鸡体内的复制能力和传播途径作了系统的比较。并采用反转录．聚合酶链反应 列差异，拟分析F株和ss株的传播特性的区别和其分子基础。 1材料和方法 1．1病毒 1．2 SPF鸡胚，SPF鸡，非免疫鸡胚和血清 SPF鸡胚种蛋购自山东省SPF鸡实验种鸡场，非免疫鸡胚由扬卅【大学实验动物中心提供。SPF鸡在本 实验室严格隔离条件下孵化，饲养至使用日龄。H9血清自制。 1．3主要试剂 PCR GelDNAExtraction ExpandHighFidelitySystem、dNTPs、Agrose Kit等为Roche公司产品，AMV vector、T4 反转录酶、pGEM-Teasy 4．0版本软件包(包括EditSeq、MegAlign、MapDraw等软件)：DNASTAR 1．4 F株和SS椿鸡胚的ELDso和EIDso测定 SPF鸡胚，0．2 4枚10d 公式计算ELDso和FAD5D。 574 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨舍 ’1．5 F株和SS株在4周龄SPF鸡气管和消化道中的复制能力比较 通过气管、口腔和滴鼻每只共计接种0．2mL。接种病毒后5d，取试验鸡气管和消化道组织(从小肠到直肠)， 秤得每只试验鸡的气管均为19，消化道为229，无菌研磨和冻融气管和消化道组织3次，分别用ImL和 3mL的含2％小牛血清、双抗灭菌的PBS溶解作为10～，按1．4方法测每个样品的EID50。 1．6 F株和SS株在4周龄SPF鸡中传播途径比较试验 组3只，分别标为接种组(g)：接种病毒；直接接触组(z)：与接种组放在同一笼子里饲养；气溶胶传播 组(q)：与接种组的同处一室；粪便接触组(f)：每日将接种组的粪便倒入笼子中饲养鸡的组，与接种组 分室饲养；健康对照组的接种组接种灭菌PBS(controlPBS)。用灭菌PBS稀释F株和ss株的尿囊液，使 口腔和滴鼻接种共计0．2mL，健康对照组接种灭菌PBS0．2mL。分别在接种后第3、5、7、9、12d采集每 心lO分钟，取上清经尿囊腔接种非免疫鸡胚，35℃的孵育，每12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚， 的血清进行m效价测试。 表1 F株和ss株在4周龄SPF鸡中传播途径试验设计 Routeof Virus Group No．chickens DOSeof inOCula廿on inoculation 1．7 ss株的HA和NA片段扩增引物的设计 为通用引物，用所有片段eDNA 于反转录。