猪睾丸组织定量pcr分析中内参基因的选择-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2017,50(15):3033-3041 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.017 猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择 彭馥芝，冉茂良，翁波，李智，董莲花，陈斌 （湖南农业大学动物科学技术学院/畜禽遗传改良湖南省重点实验室，长沙 410128 ） 摘要：【目的】采用实时荧光定量 PCR 技术（qRT-PCR）对基因表达进行分析时，选择适当的内参基因是 获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中，表达稳定的蛋白编码内参基因和 microRNA（miRNA） 内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因，为准确定量不同时期猪睾丸组织中目 的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用 8 个不同发育时期（E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、 DM）的猪睾丸组织为材料，采用 Trizol 裂解法提取各样品的总 RNA，利用 NanDrop ND-2000 分光光度计检测 总 RNA 的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的 5 个编码内参基因（GAPDH、TBP、 β-actin、SDHA 和 B2M ）以及 5 个 miRNA 内参基因（U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a 和 ssc-miR-103）的特异性引物序列，逆转录得到 cDNA 模板后，按 1:10 梯度稀释为 7 个浓度梯度进行 qRT-PCR 反应以构建标准曲线。并对 10 个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测， 采用 GeNorm 法对定量结果进行综合分析，最后根据内参基因稳定性值（M 值）的大小筛选出最稳定的参考基 因；M 值越小，表明内参基因的稳定性越好，反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、 β-actin、SDHA、B2M 、 U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a 和 ssc-miR-103 10 个候选内参基因的熔解曲线进行分析发 现，均无非特异扩增及引物二聚体，说明各内参基因特异性良好，qRT-PCR 反应的专一性高；以 Ct 值为纵坐 标，相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知，各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线 性关系；通过对 10 个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现，蛋白编码基因中，最稳 定的为 TBP，最不稳定的是 GAPDH；miRNA 候选内参中，最稳定的为 U6，最不稳定的是 ssc-miR-26a。【结论】 成功筛选出猪睾丸组织基因表达分析中稳定表达的内参基因 TBP 和 U6，可作为猪睾丸组织基因表达研究中最 佳内参基因候选者。 关键词：猪睾丸组织；内参基因；qRT-PCR；miRNA Validation of Reference Genes for Quantitative RT-PCR Analysis in Porcine Testis Tissues PENG FuZhi, RAN MaoLiang, WENG Bo, LI Zhi, DONG LianHua, CHEN Bin （College of Animal Science Technology, Hunan Agricultural University / Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, Changsha 410128 ） Abstract: 【Objective 】Reference gene is the key to obtain the accurate analysis results when apply quan