行业标准鱼腮霉病检疫技术规范编制说明-检验检疫标准管理信息系统.DOC

《丁香假单胞菌丁香致病变种检疫鉴定方法》 编制说明 1 任务来源和工作情况 1.1 任务来源 本草案是按照全国植物检疫标准化技术委员会Pseudomonas fuscovaginae)、水稻细菌性褐条病菌(P. syringae pv. panici)等多种假单胞菌属、丁香假单胞菌属进行特异性扩增验证后，证明了设计引物具有良好的特异性，能够满足对于丁香假单胞菌丁香致病变种的快速筛查检疫鉴定要求。对于形态观察、产荧光初筛、PCR筛查均为阳性的菌落进行最终的生化鉴定。 本标准草案按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》和SN/T 1345-2003《进出境植物检疫规程、检验 鉴定和除害处理标准编写的基本规定 技术工作主要内容 3.1 实验室分离培养和观察 3.1.1 样品处理方法 禾本科植物、植物材料禾本科植物、植物材料及种子随着分子生物学技术的飞速发展为植物病原丁香假单胞菌基因组种(genomospecies)的划分以及致病变种的鉴定提供了方法。Seidle等人通过PCR方法获得丁香假单胞菌丁香致病变种FF5株中的PPT酶[10]。为了对P. syringae pv.syringae进行特异性扩增，Vieira等人研究了细菌分类特异性分子标记，对6种丁香假单胞菌亚种或致病变种进行PCR扩增、斑点杂交后得到了相应细菌亚种的特异性分子标记，可以很好的对不同亚种进行鉴定[11]。丁香毒素基因作为某些丁香假单胞菌致病变种的的特异性分子标记，常用于致病变种的鉴定。其中syr B基因在产毒P. syringae pv.syringae中有着较好的保守性，已有多篇关于扩增syr B基因特异性鉴定P. syringae pv.syringae的报道[12,13]。本方法参照Sorensen等人[12]文献设计的syr B基因引物，通过优化退火温度等PCR扩增条件，获得了理想的扩增结果。PCR结果见图1，8株P. syringae pv.syringae均有一752bp大小左右扩增条带，2株P. syringae pv. panici、3株P. fuscovaginae 及3株稻种分离株P. fulva均未见相应大小扩增条带。结果表明PCR扩增特异性较强。 图2 syrB基因特异性扩增琼脂糖凝胶电泳图 M: 100bp DNA Ladder; 1-8: P. syringae pv. Syringae ; 9-10: P. syringae pv. panici ; 11-13: P. fuscovaginae ; 14-16: P. fulva 3.3.2 菌种编号及来源 为实验方便，将所有菌种进行了编号管理，具体编号及菌种来源见表2： 表2 实验所用细菌的编号及来源 P. syringae pv.syringae PSS1:NCPPB3892; PSS2: NCPPB3869; PSS3: NCPPB3782; PSS4: NCPPB3093; PSS5: NCPPB2844; PSS6: NCPPB2781；PSS7: NCPPB2748；PSS8: NCPPB2618 Pseudomonas fuscovaginae PSF1：NCPPB3598; PSF2：NCPPB3757；PSF3：NCPPB3734 P. syringae pv. panici PSP1：NCPPB4276；PSP2：NCPPB4102 Pseudomonas fulva PF1；PF2；PF3(稻种分离株) Pseudomonas syringae pv. tomato PST1: NCPPB3814；PST2: NCPPB3645 Pseudomonas syringae pv. lachrymans PSL1：NCPPB3967；PSL2：NCPPB2916 Pseudomonas syringae pv. Persicae PSPP1：NCPPB3687；PSPP2：NCPPB3579；PSPP3：NCPPB2764 Pseudomonas syringae pv. maculicola PSM1：NCPPB 3565；PSM2：NCPPB1820；PSM3：NCPPB3564；PSM4：NCPPB2039 3.3.3 特异性试验 通过优化退火温度等PCR扩增条件后，8株P. syringae pv.syringae均有特异性扩增产物。对禾本科植物中常见的P. fuscovaginae、 P. syringae pv. panici、P. fulva以及番茄细菌性叶斑病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）、甜瓜细菌性叶斑病菌(角斑病，Pseudomonas s