胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤.docVIP

蛋白质肽谱制备 凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。 ★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色 ★胶粒分为：A:一维SDS胶粒 B:二维双向电泳胶粒 凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。 ★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。 ★如果为一维SDS胶粒，需要加两个步骤： ①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min ②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机） 凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min. 4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。 ★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。） 5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。 6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。 7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。（冻干的肽段放-20度冰箱保存） 8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。） 9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。待干，再点0.5ul基质，上质谱。 溶液配制 1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中 2．脱色液配方 乙腈：50mMNH4HCO3=1:1 3. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中 4．55mmol/L烷基化溶液： 称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中 5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug -20度保存(粉末+40ul水——2~6ul分装。) 6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul） 7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液 8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1 MALDI-TOF-TOF操作手册 一：反射模式校正/测量样品的简单操作流程 1.将靶的缺角放在左下角，准备进靶。 2.新建一个spot set，或者打开一个以前建好的spot set。 3.进靶，选定靶的spot set。 4.打开Acquisition Method一级方法 ,根据校正模式修改设置，保存。 5.打开Processing Method一级方法, 根据校正模式修改设置，保存。 6.选定CAL1-CAL13进行一级校正。 7.打开Acquisition Method二级方法 ,根据校正模式修改设置，保存。 8.打开Processing Method二级方法, 根据校正模式修改设置，保存。 9.选定CAL6-CAL8进行二级校正。 10. 将Acquisition Method一级方法、Processing Method一级方法、Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法，根据测量模式修改设置，保存。 11.打开一、二级联用的方法Interpretation Method,将改好的Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法填入，保存。 12.在job模式下，填好需要测量的点，填好测量方法，进行一、二级测量。 二：反射模式校正/测量样品的详细操作流程 ★打开软件的初始界面： ★新建一个spot set 进靶，选定靶的spot set Name your spot set ★Name your plate ★select a spot set template 然后选择select ★spot set massager ★Job窗口 ★打开Acquisition Method一级方法 ★打开Acquisition Method一级方