乙肝多表位抗原基因非融合表达载体构建及表达.docVIP

乙肝多表位抗原基因非融合表达载体构建及表达 　【摘要】 目的: 研究乙型肝炎病毒（HBV）多表位基因的在原核载体中的克隆、 游离表达及其产物的抗原性。方法: 设计、 并合成HBV多表位抗原基因BPT, 克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA, 进而转化Top10大肠杆菌, 阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白（BBPT）, 并用Western blot方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果: 成功构建了原核表达载体pBAD/BPT, 在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白BBPT, Western blot 检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论: HBV多表位抗原基因的设计是成功的, 其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性, 可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。 【关键词】 乙型肝炎病毒 多表位 治疗性疫苗 　　乙肝是严重危害人类健康的疾病之一, 但目前的乙肝治疗药物如IFNα和拉米夫定（lamivudine）疗效都不很理想。治疗性疫苗作为一种新的治疗途经, 是乙肝治疗的理想方向之一。我们基于HBV表位的现有资料及前期工作, 从HBV基因组中筛选出5个高度保守的HLA识别表位肽, 串连拼接成乙型肝炎多表位抗原基因, 并在大肠杆菌中得到克隆表达。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pBAD/gIIIA及大肠杆菌BL21、 Top10由南方医科大学分子生物学院保存。T4连接酶购自Promega公司, IPTG及T载体购自天象人生物工程公司, DNA标志物及限制性内切酶EcoR I、 BamH I购自华美生物工程公司, HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程公司。复合多表位抗原基因片段的选择见文献［1］。引物合成由上海生工生物工程公司合成, 浓度2OD/管, 工作浓度6 μmol/L。 　　1.2 方法 　　1.2.1 HBV复合多价抗原基因的设计与合成 参照文献［1］。 　　1.2.2 基因的克隆及阳性重组子的筛选 根据pMD18T载体和pBAD载体的结构特征, 设计两端带有Nco I和EcoR I酶切位点的引物: 5′GCCCATGGCAATGCAGTG GAACTCC3′（上游引入Nco I酶切位点）; 5′GCGAAT TCCACCCAGACGAGCTAC3′（下游引入EcoR I酶切位点）。以CAG176为模板［1］, PCR扩增出乙型肝炎预防治疗性疫苗基因BPT(扩增条件: 94℃变性5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 50 s, 72℃ 55 s, 扩增30个循环, 最后72℃延长10 min)。PCR扩增产物以冻融法割胶回收, 与T载体15℃连接过夜后转入大肠杆菌DH5α, 涂板培养, 挑取单菌落培养, 抽提质粒T/BPT, 以Nco I和EcoR I酶切T/BPT及载体pBAD, 冻融法回收小片段和大片段, 两者15℃连接过夜, 转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养。挑取单菌落抽提质粒, 以Nco I和EcoR I双酶切, 并以该质粒为模板, 上述引物和PCR扩增条件进行扩增, 酶切产物及扩增产物均以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 以筛选出阳性重组子。 　　1.2.3 BPT原核表达载体的构建和表达 筛选出的阳性重组克隆转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养, 挑取单菌落在LB培养基中培养过夜后, 按1％接种量接种到2 mL LB培养基中, 培养4 h后加200 G/L的阿拉伯糖至质量终浓度为0.2 g/L诱导表达, 3 h后收菌, 取菌液0.5 mL, 离心后去上清, 沉淀中加入100 μL pH=8.0的TE和100 μL 2×SDS蛋白上样缓冲液, 混匀后沸水中煮10 min, 取20 μL 上样, 行150 g/L SDSPAGE蛋白电泳。 　　1.2.4 蛋白的纯化 使用SPSepharose阳离子柱层析纯化HiTrap , SPSepharose HP 5 mL 预装柱经20 mmol/L、 pH9.0的Tris.CL缓冲平衡液, 将透析液上SP柱, 用20 mmol/L、 缓冲液及含1 mol/L NaCl的 TrisHCl缓冲液（ pH9.0）进行梯度洗脱并分步收集洗脱峰。 　　1.2.5 Western blot检测融合蛋白与HBV患者血清反应的免疫特异性 Western blot方法参照《分子克隆实验指南》第2版进行, 一抗为BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清［2］, 1∶20稀释。二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG, 1∶300稀释, DAB显色。 　　2 结果 　　2.1 pBAD/ BPT重组表达质粒的构建 以CAG176为摸