乙肝病毒表面抗原G145R变异单克隆抗体制备及其初步鉴定.docVIP

乙肝病毒表面抗原G145R变异单克隆抗体制备及其初步鉴定 　【摘要】 目的: 研制抗乙肝病毒G145R变异表面抗原的单克隆抗体(mAb)。方法: 将重组乙肝病毒G145R变异表面抗原以Al(OH)3佐剂化, 常规免疫BALB/c小鼠, 采用细胞融合技术制备抗乙肝病毒G145R变异表面抗原的mAb。采用ELISA对制备物的效价与特异性进行鉴定, 将其用于部分临床标本的检测, 并与德国抗HBs mAb GL2.001进行比较。结果: 获得1株稳定分泌抗G145R HBs mAb的杂交瘤细胞, 命名为4E12。该细胞株染色体数目为90条, 所分泌mAb属IgG1亚类。其培养上清与腹水抗G145R HBs ELISA效价为(0.5～1)×103及(1～10)×106。经持续3月培养, 低血清适应以及反复冻存与复苏后, 其细胞增殖能力与上清抗G145R HBs效价与克隆化结束时大致相似。将其与德国抗G145R HBs mAb GL2.001相比, 二者对重组乙肝表面抗原G145R变异S蛋白的反应性大致相当, 灵敏度前者稍低于后者（分别为2.0 μg/L与1.0 μg/L）。对野生株表面抗原的检测前者在实验浓度范围内未显示有意义的反应信号, 后者在与高浓度（1 mg/L及以上）抗原反应时S/N值达到或高于3.9。将二者用于对一组特定患者的临床检测, 其阳性率前者（17/200, 8.5%）较后者（11.5%）略低, 其差别经统计学比较无统计学意义（Pgt;0.05）。结论: 成功地制备了1株抗乙肝表面抗原G145R变异体的mAb, 为乙肝G145R变异的基础、 临床与流行病学研究提供了进一步的物质基础。 【关键词】 乙型肝炎病毒 免疫逃逸变异 HBsAg G145R变异 单克隆抗体 　　新近资料显示, 不同试剂对G145R变异HBsAg（mtHBsAg G145R）的检测能力仅为对野毒型HBsAg检测 的50 %或更低［1］, 这给HBV感染的免疫学诊断、 血源筛选和乙肝疫苗的研制提出了新的问题。为深入开展乙肝病毒免疫逃逸变异的临床与流行病学研究, 我们在既往工作的基础上采用杂交瘤技术进行抗乙肝病毒表面抗原G145R变异单克隆抗体（抗G145R HBs mAb)的研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 RPMI1640培养基购自Gibco公司; BALB/c小鼠由湖北省疾病预防控制中心动物室提供; Al(OH)3凝胶和重组野生HBsAg（wtHBsAg, CHO细胞表达, 纯化疫苗前体）等由中国生物制品总公司武汉生物制品研究所提供; Sp2/0细胞由中国典型培养物保藏中心提供; PEG4000、 HAT与HT、 以及小鼠免疫球蛋白亚类检测试剂等均购自Sigma公司; 山羊抗小鼠IgG及HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体购自美国Pierce公司; HRP标记山羊抗HBs多克隆抗体, 纯化mtHBsAg G145R、 mtHBsAg G145R－ELISA质控参照品及其抗HBs G6 mAb（下称G6 mAb）等由本室制备［2, 5］。卫生部国家临床检验中心（NCCL）颁定之HBsAg ELISA质控血清由湖北省临床检验中心提供。抗G145R HBs GL2.001.2 mAb由德国ESSEN大学病毒研究所陆蒙吉教授惠赠（下称 GL2.001 mAb, 该抗体能与mtHBsAg G145R结合）［3］。2A8细胞系（分泌mtHBsAg G145R）由本院临床免疫研究室提供［4］。 　　受检血清200份(年龄20～56岁)自本院检验科和感染病病原实验室采集, 类型为: （1）临床报告HBsAg呈阴性, 但有一项或几项除HBsAb以外的HBV标志物呈阳性; （2）HBsAg、 HBsAb双阳性。正常对照血清40份, 均有成功的乙肝疫苗接种史, 抗HBs阳性, 其他HBV标志阴性, 且生化指标及其他肝炎病毒标志均正常。 　　1.2 方法 　　1.2.1 杂交瘤细胞株的建立 （1）小鼠免疫:初次免疫用纯化的 mtHBsAg G145R（5 μg/只）与Al(OH)3混合置4℃过夜, 经背部皮下多点注射进行免疫。2周后, 用相同剂量的抗原及相同的方法进行2次免疫。于细胞融合前3 d, 再用同等剂量的抗原(未佐剂化)腹腔注射进行加强免疫。（2）细胞融合: 按本室以往报道方法进行［6］。（3）杂交瘤细胞的筛选: 采用ELISA A及ELISA B分两步进行, 用于筛选A法强阳性而B法阴性的杂交瘤细胞克隆。ELISA A: 先用山羊抗小鼠IgG包被（包被浓度2.5 mg/L）, 4℃过夜。次晨洗板5次, 每次1 min, 再以10 g/L的BSA封闭, 37℃放置2 h后, 加入待筛选的杂交瘤细胞培养上清