MMP9基因多态性及IgA肾病病理改变关系.docVIP

MMP9基因多态性及IgA肾病病理改变关系 　【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶9(MMP9) C1562T基因多态性与IgA肾病病理改变间的关系。方法 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析技术检测88例IgA肾病患者的MMP9 C1562T多态性，进一步研究其与IgA肾病病理分级间的相关关系。结果 IgA肾病患者MMP9 C1562T基因型分布频率为：CC基因型65例(73.9%)，CT基因型23例(26.1%)，TT基因型缺如。其基因型与IgA肾病病理分级比较，差异无显著性(Pgt;0.05)。结论 MMP9 C1562T基因多态性可能不影响IgA肾病的病理改变和预后。 【关键词】 基质金属蛋白酶9 C1562T基因;遗传多态性;IgA肾病; 病理改变 长期以来，肾小球疾病的易感性和预后与遗传因素之间的关系，一直是肾脏病学界广泛关注的问题。基质金属蛋白酶家族是肾脏内主要的基质降解酶体系，主要参与血管基底膜主要结构成分——Ⅳ型胶原的降解。作为降解血管基底膜中Ⅳ型胶原的主要酶类，其活性的高低直接影响着肾小球内细胞外基质的表达量与局部沉积。肾脏疾病患者肾组织表达MMP9增高，有助于消除产生过多的细胞外基质，是肾组织纤维化形成的一种自身抑制反应〔1〕。已发现MMP9主要表达于肾小球的足细胞和内皮细胞，且在IgA肾病增殖性肾小球内表达显著增多，在硬化性肾小球内表达减少〔2〕。而另一个突出的事实是，IgA肾病即便是具有大体相同的临床表现，比如高血压、蛋白尿，且应用相同的治疗措施，但临床疗效和预后却不尽相同。于是推测IgA肾病除了受非遗传因素的影响外，还受遗传因素的影响。目前已明确MMP9基因存在多态性，但没有关于MMP9基因多态性(1562C/T)与肾脏疾病的相关性报道。笔者以IgA肾病为研究对象，检测了其MMP9基因C1562T多态性的分布，并与IgA肾病的病理改变进行比较，从而探讨MMP9基因是否影响IgA肾病的病理改变和预后。 　　1 资料与方法 　　1.1 研究对象 选择2005至2006年在本校第一医院和第二医院住院并通过肾活检确诊的IgA肾病患者88例。排除心、脑、肝及糖尿病等疾病。其中年龄20～68岁，平均(34.49±15.06)岁。 　　1.2 方法 　　1.2.1 肾脏常规病理和免疫荧光检查 88例肾活检标本均行HE、PAS、PASM、MASSON染色，光镜下观察肾小球、肾小管间质病变的性质和程度;冰冻切片下直接免疫荧光染色方法，观察IgA、IgM、IgG、C3、C4、C1q及纤维蛋白原在肾脏中的沉积部位、分布特点及强度。按Lee分级标准将肾脏改变分为Ⅰ～Ⅴ级。 　　1.2.2 基因组DNA的提取 采静脉血4 ml，EDTANa2抗凝，按常规酚/氯仿/乙醇法提取白细胞基因组DNA。 　　1.2.3 引物 由上海生化生物工程公司合成。引物1：5′GCCTGGCACATAGATGGCCC3′;引物2：5′CTTCCTAGCCAGCCGGCATA3′。 　　1.2.4 PCR扩增 10×Buffer 3 μl，dNTPMix 2.4 μl，引物1、2各1 μl，DNA模板 3～10 μl，去离子水12.4～19.4 μl，耐热Taq DNA聚合酶(大连TAKARA公司)0.2 μl(终体积30 μl)，将上述试剂混匀，加入无菌石蜡油 50 μl，覆盖液面，以防蒸发。离心后置于PCR仪(Habaid型)。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s;进行35个循环，最后一次循环结束后在72℃延伸7 min。用1.2 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察结果、摄片，确认有无长度为435 bp的目的基因片段。 　　1.2.5 限制性内切酶SphⅠ进行酶切鉴定分型 去离子水11 μl，10×Buffer 2 μl，限制性内切酶SphⅠ(New England Biolabs公司)1.0 μl，PCR产物5 μl混匀，37℃消化过夜，1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察结果、摄片。C型基因不含SphⅠ酶切位点，T型基因含SphⅠ酶切位点，并被切为247 bp和188 bp 2个基因片段。即分型标准为：CC型可见1个435 bp基因片段，TC型可见435 bp、 247 bp和188 bp 3个基因片段，TT型可见247 bp和188 bp 2个基因片段。 　　1.3 统计学处理 用基因计数法统计基因型和等位基因的分布频率，用HardyWeinberg平衡法检验基因频率的群体代表性，基因型频率比较用Fisher′s Exact检验，用SPSS13.0软件进行数据处理。 　　　2 结 果