CIK细胞对白血病微小残留病作用探究.docVIP

CIK细胞对白血病微小残留病作用探究 　 作者：肖中平 封韬 王雪野 韩梅 肖中平 【摘要】 目的 观察CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞的杀伤作用，对G0期CD34+白血病细胞的细胞毒作用，及对正常骨髓造血干细胞的影响。方法 取急性白血病(AL)化疗后、慢性粒细胞白血病(CML)慢性期及正常人外周血单个核细胞加入一系列细胞因子诱导培养CIK细胞，流式细胞仪检测CIK表型，G带法分析CIK细胞核型。冻存、复苏后作为靶细胞，MTT法测定CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞杀伤作用。AO染色法测定复苏后G0期急性粒细胞白血病(AML) CD34+细胞比例及培养后CML CD34+细胞中G0期细胞比例。流式细胞仪检测CIK细胞杀伤前后G0期CD34+细胞比例变化。半固体培养法检测CIK细胞对正常骨髓CFUGM、BFUE集落形成的影响。结果 CIK细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞，对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，对G0期白血病细胞有明显抑制作用，对正常造血干细胞无杀伤作用。结论 CIK细胞可作为清除残留白血病细胞的有效工具。 【关键词】 白血病；微小残留病；CIK细胞 完全缓解的白血病患者体内，常残存耐药的、处于静止期的微小残留白血病细胞，是复发的根源。本研究从白血病患者外周血中培养出的CIK细胞，不含有白血病干细胞，能有效杀伤G0期CD34+白血病干细胞，而且这种杀伤作用具有选择性，不损伤正常造血干细胞，可以作为有效的免疫细胞来清除白血病患者体内的为微小残留病（MRD），值得临床使用。 　　1 材料和方法 　　1.1 对象 　　本院血液科2005年1月至2008年10月15例急性白血病（AL）治疗后完全缓解（CR）患者，5例慢性粒细胞白血病（CML）慢性期患者，5例正常人。诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》〔1〕。 　　1.2 试剂和仪器 　　白介素(IL)1，英国Pepro Tech INC公司；IL2，沈阳三生公司；CD3抗体，美国PharMingen公司；干扰素(IFN)γ，英国Pepro Tech INC公司；CD3FITC单抗、CD56PE单抗、CD34APC单抗、IgGFITC单抗、IgGPE单抗，美国PharMingen公司；EPICS XL流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 CIK细胞的培养与测定 　　（1）CIK细胞的诱导与培养：取15例AL化疗后CR患者、5例CML患者、5例正常人外周血分离单个核细胞，第1天加入IFNγ 1 000 μl/ml,第2天加入CD3单抗50 ng/ml、IL2 1 000 μl/ml、IL1 100 μl/ml，诱导培养CIK细胞。（2）流式细胞仪(FCM)检测CIK细胞表型：在培养至第1、2、3周时，分别取105 CIK细胞，标记CD3FITC单抗、CD56PE单抗20 μl，对照管加入IgGPE、IgGFITC 20 μl，避光孵育20 min，用PBS洗涤后，再加1 g/L多聚甲醛固定，4℃避光保存，1 w内上机检测。（3）染色体G带法分析CIK细胞核型：取4例CML 患者、1例APL患者外周血单个核细胞培养至第3～4周CIK细胞5 ml(1×106/ml),加秋水仙胺至终浓度0.03 ng/ml,置于37℃、5％ CO2孵箱中培育3 h后离心、低渗处理、预固定、离心、固定、离心、再次固定、离心、再固定，制备中期染色体标本，Gimsa 染色后镜检及摄影。 　　1.3.2 CIK细胞对急、慢性白血病细胞的杀伤作用 　　（1）靶细胞（白血病细胞）制备：取上述患者初诊时骨髓5 ml，肝素抗凝，以RPMI 1640按2∶1体积混合稀释，将此稀释液缓慢加入含有5 ml Ficoll的离心管中，2 000 r/min离心20 min后吸取单个核细胞层，以RPMI 1640清洗2次后，用含20%胎牛血清和10%DMSO的1640作为冻存保护液，程序降温至-196℃液氮中保存。（2）靶细胞（白血病细胞）复苏：从液氮中取出上述白血病细胞冻存管，迅速放入37℃水中，摇动使其尽快融化，吸出细胞悬液，注入离心管中，加入10 ml培养液混匀，1 000 r/min离心10 min，吸弃上清液，再重复用培养液洗1次；培养液稀释细胞至1×106/ml，接种于培养瓶中，培养1～2 d，培养后台盼蓝拒染法计数活细胞＞95%后备用。（3）MTT法测定CIK细胞对原代急慢性白血病细胞杀伤作用：将白血病细胞浓度调至1×105/ml，效应细胞即CIK细胞浓度分别调至2×106/ml，5×105/ml，1×105/ml，即效靶比分别为20∶1、5∶1、1∶1。取96孔无菌培养板，实验组加效、靶细胞各100 μl，靶细胞对照组（白