D半乳糖致衰老小鼠学习记忆行为改变及对海马神经发生影响.docVIP

D半乳糖致衰老小鼠学习记忆行为改变及对海马神经发生影响 　 作者：余资江 康朝胜 李宏伟 文敏 【摘要】 目的 探讨D半乳糖衰老模型小鼠学习记忆行为变化及对海马齿状回细胞增殖的影响。方法 采用连续皮下注射D半乳糖构建亚急性衰老小鼠模型，用Y电迷宫检测衰老小鼠的学习记忆情况，并于造模完成前7 d腹腔内注射5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，行为检测完成后，取海马脑块行常规石蜡包埋，冠状连续切片，采用免疫组化法检测齿状回BrdU阳性细胞并计数。结果 衰老模型小鼠呈现明显的学习记忆减退，其齿状回增殖细胞数量与正常衰老相近。结论 采用连续皮下注射D半乳糖可成功构建衰老模型，其学习记忆障碍可能与齿状回细胞增殖抑制有关。 【关键词】 D半乳糖；海马；神经发生；学习记忆 神经系统的老化，对机体的衰老过程具有重要影响。成年哺乳动物包括人类脑中普遍存在着神经发生。海马脑区的神经发生是由位于齿状回颗粒下区(SGZ)的前体细胞驱动的〔1，2〕。SGZ的神经发生能力随着年龄进程而下降，持续的神经元丢失，同时神经发生障碍，不能产生新的神经元，最终导致学习记忆能力下降及其他神经退行性疾病的发生〔3〕。研究表明，D半乳糖致亚急性衰老动物模型不仅能较好地模拟与自然衰老相似的代谢紊乱特征，同时具有学习记忆功能下降的衰老表现，常运用于研究老年性疾病〔4〕，但该模型是否引起海马齿状回神经发生的抑制尚少见报道，本文试图从神经发生的角度探讨衰老模型小鼠的学习记忆的改变。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 40只健康3月龄雄性昆明小鼠，体重(20±1.05)g〔贵阳医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(黔)20020001〕，经Y型迷宫初步筛选，筛选标准：选择活跃、对电击反应较敏感，逃避反应迅速者，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的小鼠，初筛36只小鼠，分为2组：模型组，28只，皮下注射D半乳糖(Dgal，AMRESCO公司)构建衰老小鼠模型，注射剂量为125 mg·kg-1·d-1；对照组，8只，皮下注射生理盐水。另设衰老组，取自然衰老小鼠(24月龄)8只。3组小鼠均于处死前7 d，腹腔内注射5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU，Sigma公司)，注射剂量为50 mg/kg体重，连续7 d。于模型构建完成后次日通过Y迷宫检测小鼠的学习记忆行为。 1.2 Y型迷宫检测移植前后小鼠的学习记忆行为 学习测试：采用随机休息法进行测试。安全区以无规则次序变换，以训练小鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。小鼠受电击后逃到安全区后，灯光继续作用10～15 s，熄灯后结束1次测试，小鼠所在支臂就作为下1次测试的起点，两次测试时间间隔30 s或休息1 min后再予以第2次测试，依次重复，测试至连续10次测试有9次以上正确者为判定标准。记忆保持测试：于学习测试24 h后，再以同样方法测试至9/10标准。正确反应次数定为A，以A/10表示记忆的保持能力，此值越高说明记忆力越好。 1.3 动物取材、制片及免疫组化染色 于行为检测完毕后次日进行取材，所有小鼠经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，打开腹腔，暴露胸腔后，经升主动物插管，先注入20～30 ml生理盐水以冲洗血液，待小鼠肝脏颜色变浅后，改用Bouin液灌注固定，每只动物灌注量约30 ml；动物灌注完毕后，开颅取出脑组织，置于Bouin液中后固定24 h后，进行常规石蜡包埋；将各组包埋好的组织块，行冠状边续切片，片厚6 μm，行 BrdU免疫组化染色。BrdU免疫组化染色步骤简述如下：石蜡切片常规脱蜡至水后，滴加1∶1的50%甲酰胺/2×SSC，65℃孵育2 h，入37℃ 2 mol/L HCl浸泡 60 min使DNA变性；0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH=8.5)中和10 min，PBS冲洗5 min×3次；用3%H2O2甲醇溶液孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡；滴加正常山羊血清封闭液，室温15 min，倾去不洗。滴加鼠抗BrdU单克隆抗体(滴度1∶1 000，Sigma)，37℃孵育2～3 h，PBS冲洗，滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG(1∶100，北京中山)，37℃ 15 min，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液(北京中山)，37℃ 15 min，PBS洗，DAB显色，镜下控制显色时间，流水冲洗后脱水、透明，中性树胶封片并镜检。免疫组化及免疫荧光检测过程中均以PBS代替一抗设置阴性对照，按照试剂盒操作说明进行。在40×10光镜下对各组小鼠海马齿状回BrdU阳性细胞进行计数，计数结果进行数据分析。 1.4 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行t检验。 2 结 果 2.1 各组小鼠学习记忆检测结果 经Y型迷宫检测小鼠学习和记忆行为表明，与对照组相比，模型