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单子叶植物内生菌多糖抗肿瘤活性探究 　 作者：章传华 周高峰 魏继刚 曾汉清 柳懿鹏 段志国 【摘要】 目的:研究单子叶植物内生菌多糖抗肿瘤活性。方法:用单子叶植物内生菌多糖对S-180和H 22肝癌荷瘤小鼠进行体内和体外抑瘤实验，单子叶植物内生菌多糖对S-180荷瘤小鼠细胞分裂指数实验。结果:单子叶植物内生菌多糖对小鼠S-180实体瘤和H22小鼠肝癌具有抑制作用（ P lt;0.001）;单子叶植物内生菌多糖可干扰肿瘤细胞的细胞周期，抑制其分裂。结论:单子叶植物内生菌多糖具有一定的抗肿瘤活性。 【关键词】 单子叶植物内生菌; 多糖; 肿瘤 　　植物内生菌广泛存在于各种植物中，其分布广、种类多。有关植物内生菌生物活性物质在医药领域的应用研究是目前的一个研究热点，内生菌可产生丰富多样的次生代谢产物，许多研究结果表明植物内生菌代谢产物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎症、免疫调节、降糖等多种生物活性［1～4］。单子叶植物内生菌是一种新发现的植物内生菌，其产生的多种生物活性物质在医药方面可能具有重要的应用潜力。关于单子叶植物内生菌多糖提取物（简称内生菌多糖）药物作用的相关研究极少。为此，本研究将对单子叶内生菌菌体多糖抗肿瘤活性进行初步探讨。 　　1材料与方法 　　1.1材料单子叶植物内生菌由中国科学院武汉植物研究所张正荃研究员惠赠。BALB/c纯系小鼠，8～12周龄，体重20±1g，雌雄兼用，由武汉大学医学实验动物中心提供。小鼠肝癌H22细胞株由北京市肿瘤研究所提供;S-180肉瘤细胞株，由武汉大学医学院免疫系提供。试剂:RPMI1640（GIBCO），噻唑蓝（MTT）。CO2细胞培养箱为德国Heraeus公司产品。 　　1.2方法 　　1.2.1内生菌多糖提取 将内生菌接种培养基琼脂斜面上28℃培养48h，接种于100ml培养基中（500ml三角瓶装），28℃振荡培养48h，然后转种至发酵培养基中（接种量为10%），在28℃振荡摇档上培养96h，生物活性最高，随即放瓶提取。取细菌发酵液（15000g、离心25分钟）洗涤3次，加入3倍体积的95%冷乙醇，4℃过夜;5000g、20min、收集上清、弃细菌，加入KCl （终浓度1%w/v），加入3倍体积的95%冷乙醇重复提取3次，加入蒸馏水，上大孔吸附树脂，收集流出液，冷干浓缩。冷干品用适量水溶解，上DEAE-SephadexA25柱，收 集流出液，冷干，用适量水溶，以75%乙醇沉淀，收集沉淀。沉淀用水溶后，装入透析袋透析，收集袋中液体。多糖的鉴别: ①茚三酮反应为阴性，α-萘酚反应为阳性; ② UV（λmaxH2 O，nm）:198.8; ③ SDS电泳:以10～15V/cm电压进行电泳，结果显示无明显条带，证明内生菌多糖不含蛋白质。样品用生理盐水和RPMI1640培养液配成20g/L，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，临用前用培养液稀释到所需浓度。 　　1.2.2内生菌多糖体内抗肿瘤实验 ①取接种7d生长良好的腹水型S-180荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，取腹水，用生理盐水稀释成每毫升含1×107 个瘤细胞的悬液，接种于实验小鼠右前肢腋窝皮下，每只小鼠接种0.2ml瘤细胞悬液。将接种S-180肉瘤的小鼠随机分为生理盐水组、实验组和环磷酰胺阳性对照组，标号并称重。接种S-180肉瘤细胞后24h，生理盐水组每只小鼠隔天连续给与实验组给药容积相等的生理盐水1次;实验组每只小鼠隔天按50与100mg/kg剂量给药1次;阳性对照组给予环磷酰胺，每只小鼠隔天按30mg/kg剂量给药1次。各组小鼠于实验的第12天，分别颈椎脱臼处死，完整剥出瘤体，称重，计算抑瘤率。 ② 内生菌多糖抑制小鼠肝癌H22的实验:方法同上。 　　1.2.3内生菌多糖体外抗肿瘤实验 分别取接种7d生长良好的腹水型S-180肉瘤小鼠和腹水型H22肝癌的小鼠，颈椎脱臼处死，取腹水，用生理盐水稀释成每毫升含1×106 个瘤细胞的悬液， 以每孔400μl接入48孔培养板，24h后加药50μl，使多糖浓度分别为25μg /ml、50μg /ml、100μg /ml，同时设环磷酰胺阳性对照组，使其浓度为30μg /ml，阴性对照组加相应体积的含10%新生牛血清RPMI 1640培养液，培养48h后，每孔加MTT40μl，继续孵育4h，弃上清，加入酸化异丙醇40μl，终止反应，转至酶标板上，490nm测定吸光度。 　　1.2.4内生菌多糖对小鼠S180肉瘤生长及存活期的影响 荷瘤小鼠模型方法同上。将接种S-180瘤细胞的小鼠随机分为生理盐水组、实验组和阳性对照组，标号并称重。接种S-180瘤细胞后24h，生理盐水 组每只小鼠隔天连续腹腔注射与实验组给药容积相等的生理盐水1次;实验组每只小鼠隔天按50、100与200mg/kg剂量给药1次;阳性对照