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克霉唑药膜微生物限度检查方法验证试验探究 　【关键词】 克霉唑； 薄膜过滤法； 抑菌活性 克霉唑（Clotrimazole）药膜作为阴道局部外用制剂，中国药典2005（CP2005）年版二部对受微生物污染的微生物限度有明确要求，对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查，首先应排除抗菌活性，经验证试验来确认其抑菌活性是否去除而不影响检验结果，保证检验结果的准确性。2007年11月~2008年2月为建立克霉唑药膜微生物限度检查方法，参考中国药典，以试验菌的回收测定为主要方法，测定克霉唑膜制剂在微生物限度检查条件下对细菌、霉菌、酵母菌的代表菌的抑菌活性，并进行方法选择试验［1，2］；对筛选出的敏感菌选择用离心沉淀与薄膜过滤法联用消除其抑菌活性，经选择试验确定供试液浓度及冲洗条件，按筛选出的方法作3个批号计数方法的验证，对方法进行评价［3］；对控制菌检查方法进行了验证试验研究，建立克霉唑药膜的微生物限度检查方法。 1 实验材料及仪器 1.1 仪器与样品 ＨＴＹ-2000型智能集菌仪、多次使用集菌器、一次性薄膜过滤器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、离心机（800型沉淀离心机，上海手术器械十厂）、高压蒸汽灭菌器、电子天平、生物安全柜、生化培养箱等。克霉唑药膜 （ 规格：4mg，贵州德轩堂制药有限公司生产批号：051225、051226、051227）。 1.2 培养基、稀释剂及试剂 营养琼脂、营养肉汤、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、胆盐乳糖增菌培养基、溴化十六烷基三甲胺琼脂、亚碲酸盐肉汤、甘露醇氯化钠琼脂、0.9%氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（中国北京三科科技开发公司生产，按CP2005版规定配制及灭菌）［1］。 1.3 试验用菌种 大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylocoddus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白色念珠菌Candida aibicans、黑曲霉Aspergillus niger、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC（B）10104]，菌种均来源于中国医学细菌保存中心，均为不超过5代的菌株［1］。 2 方法 参照CP2005年版二部附录微生物限度检查法中计数方法的验证、控制菌检查方法的验证。 2.1 菌液制备方法 取经（36±1）℃培养16~18 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌肉汤新鲜培养液，加入0.9%氯化钠溶液或营养肉汤，10倍递增稀释制成50~100 cfu/ml菌液，计数备用。取经26 ℃培养24~48 h的白色念珠菌的改良马丁液体新鲜培养液，用0.9%氯化钠溶液10倍稀释制成50~100 cfu/ml菌液计数，备用。取经26 ℃培养5~7 d的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加适量0.9%氯化钠溶液洗下孢子，取孢子悬液加入0.9%氯化钠溶液10倍稀释制成50~100 cfu/ml孢子悬液计数，备用。 2.2 供试液制备方法 取样品100 cm2，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，振摇，使充分分散均匀，即为1∶10供试液； 取上述1∶10供试液10 ml加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别至50、100、200 ml，即为1∶50、1∶100、1∶200供试液。 2.3 敏感菌的确定及细菌、霉菌、酵母菌计数方法选择试验及验证试验方法 为确定克霉唑药膜的敏感菌，选择有效的去除抑菌活性的方法，用CP2005年版平皿稀释法、低速离心沉淀处理供试液与平皿稀释法联用、低速离心沉淀处理供试液与薄膜过滤法联用消除其抑菌活性［1，2］；对试验菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉进行活菌计数回收试验，从各菌的回收结果确定敏感菌，选择出回收率在70%以上的方法作为有效方法，各试验菌作3个批号验证试验以对方法进行评价。 2.3.1 平皿稀释法［1］ 每皿中分别加入1∶10供试液1 ml、0.2 ml，每皿分别各加入试验菌50~100 cfu，立即倾注规定的琼脂培养基15~20 ml，每种试验菌平行制备2个皿，置规定温度，培养、计数菌落数作为试验组；不加入供试液，同法测定相应加入的试验菌数，作为菌液组；不加入试验菌，同法测定1∶10供试液1 ml、0.2 ml中的本底菌数作为空白组，计算回收率。回收率（%）=[(试验组平均菌落数-空白组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100%。 2.3.2 离心加薄膜过滤法联用 取供试液10 ml于500 r/min离心4~5 min，管底离心沉淀物0.25 ml，取出全部上层液混匀，即为供试液，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（冲洗液室温或加热至40~45 ℃）约90 ml中，混匀过滤冲洗，