海南省及河南省发生甜瓜褪绿黄化病分子鉴定.docVIP

海南省及河南省发生甜瓜褪绿黄化病分子鉴定摘 要：【目的】为了探明引起海南省和河南省甜瓜褪绿黄化的病因，【方法】提取从海南三亚和河南郑州采集的甜瓜叶片的RNA，用CCYV特异性引物进行外壳蛋白基因的克隆、测序，并与GenBank中同属或同种病毒的cp基因核苷酸序列构建系统进化树。【结果】结果显示，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，所得条带在880 bp左右，与预期的一致；构建cp基因的系统进化树发现，样品与瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）的亲缘关系很近，属于同一个分枝，而与该病毒同属不同种的南瓜黄矮失调病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV）和大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV） 的亲缘关系较远，属于不同的分枝。【结论】证实海南省和河南省甜瓜褪绿黄化病是由瓜类褪绿黄化病毒引起。 关键词： 甜瓜； 瓜类褪绿黄化病毒； 外壳蛋白基因； 黄化 中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0291-03 瓜类褪绿黄化病是一种近年爆发的新病害，病原为瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）。该病毒属于长线病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus），通过烟粉虱以半持久性方式传播，已知在自然界主要侵染葫芦科作物的甜瓜、西瓜、黄瓜。植物感染CCYV后，通常中下部叶片先感染，逐步向上发展，新叶常无症状。叶片开始出现褪绿， 随着病情发展，叶片黄化，同时仍能看见保持绿色的局部组织， 最后全叶黄化，但叶脉仍保持绿色。该病害最早于2004年在日本发现[1]，我国于2007年，在上海、宁波发现，目前已分布于广西、江苏、山东、浙江[2]和台湾[3]，此外该病在苏丹[4]和黎巴嫩也有发生。关于该病害在我国的南北分布仍然不清楚，2011年我们实地调查海南三亚和河南郑州的甜瓜病毒病发生情况，观察到设施甜瓜普遍发生黄化。从发病的大棚采集病叶，通过病毒外壳蛋白基因（cp）的克隆和序列分析，证实样品系CCYV病毒感染。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样品 2011年3月在海南三亚乐东县佛罗镇长流村、福塘村、莺歌海、尖峰镇；2011年10月在河南郑州河南农业大学实验园区采集表现褪绿黄化的甜瓜叶片，编号分别为SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1，保存于-80 ℃。 1.1.2 试剂 M-MLV反转录酶、dNTPs、RNAiso Plus试剂、TaqDNA聚合酶、Ribonuclease Inhibitor和T载体pMD18-T等分子生物学试剂，产品购自宝生物工程有限公司；75%乙醇（DEPC处理水配制）、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 植物总RNA的提取 参照TaKaRa RNAiso Plus试剂盒的说明，从所采集的甜瓜叶片中提取总RNA。称取0.2 g样品于干热灭菌的研钵中加液氮研磨，加700 μL的RNAiso Plus后匀浆，静置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，取上清加入140 μL的氯仿振荡混匀，静置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min，取上清并加入等体积的异丙醇，静置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min。加入1 mL的75%乙醇洗涤沉淀，12 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，弃上清保留沉淀，晾干，溶解于30 μL的DEPC处理水中。 1.2.2 cp基因扩增 根据GenBank发表的CCYV的cp序列，设计一对特异性引物CP-F： CGTAAGTGATCGCAATCAAT，CP-R： AGTGATCACTTGACCATCTCC，扩增片段长度876 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 以提取的总 RNA 为模板进行反转录，反应体系为10 μL。向经过DEPC处理的0.2 mL的离心管中加入3 μL RNA、1 μL CP-R 10 μmol·L-1、3.5 μL dNTPs 25 mmol·L-1、2 μL 5×M-MLV Buffer、0.2 μL的RNA酶抑制剂 40 u·μL-1和0.3 μL的M-MLV反转录酶200 u·μL-1，42 ℃水浴1 h。 PCR反应采用15 μL体系，含ddH2O 7.7 μL、10×PCR缓冲液 1.5 μL、dNTPs 2.5 mmol·L-11 μL、反转录产物2.5 μL、10 μmol·L-1的CP