应用分子生物学及蛋白组学技术快速鉴定金黄色葡萄球菌.pdfVIP

金黄色葡萄球菌 摘要 金黄色葡萄球菌是分布最广泛的致病菌之一，它分泌多种毒力因 子u1，可导致肺炎，伤口感染及食物中毒等严重疾病，占医院感染病 例的10％。近年来，随着抗生素的广泛应用，导致了耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌(脉SA)的大量出现，使其成为与艾滋病、乙型肝炎并 列的世界三大感染顽疾。传统的检测方法具有操作简便，所需设备简 单的优点，但都存在耗时长、灵敏性差的缺点。随着分子生物学技术 和蛋白组学技术的广泛应用，对金黄色葡萄球菌的检测也从传统方法 过渡到以PCR、杂交探针、基因芯片和MS为主的现代技术上，从基 因和蛋白质水平更准确、更灵敏的检测病原菌的存在。本研究首先采 用PCR-RFLP(聚合酶链反应．限制性片段长度多态性分析)鉴定了I临 床常见的葡萄球菌，然后利用差异蛋白组学的方法，运用 SELDI．TOF．MS质谱技术检测金黄色葡萄球菌以及其他对照组细菌 的蛋白指纹图谱，并筛选出金黄色葡萄球菌的特异表达蛋白标志物， 建立决策树预测模型，探讨其用于金黄色葡萄球菌实验室诊断的临床 价值。 目的 细菌分子水平的鉴定是目前I隘床实验室微生物领域研究的一个 热点。本研究利用聚合酶链反应．限制片段长度多态性分析技术和 差异蛋白组学技术快速鉴定临床常见的金黄色葡萄球菌，为临床微 生物鉴定方法的研究奠定了基础。 方法 1．采用四种DNA提取方法提取金黄色葡萄球菌DNA，筛选适宜的 DNA提取方案。2．PCR扩增金黄色葡萄球菌的16SrDNA，产物测序， 结果与GenBank比对进行鉴定。3．获取葡萄球菌tuf基因序列，通过 软件分析tuf基因的酶切位点和酶切模式。优化PCR检测tuf基因的 反应条件，采用PCR扩增葡萄球菌tuf基因，产物经限制性内切酶 AluI，mnfl酶切后，琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，根据酶切模式对 葡萄球菌进行鉴定。4．选择不同激光强度，探讨并建立 SELDI．TOF．MS检测细菌蛋白指纹图谱的条件。5．收集培养24h、 分析培养时间对蛋白指纹检测的影响。6．将3株金黄色葡萄球菌均 重复检测20次，分析SELDI．TOF．MS检测细菌蛋白指纹的重复性。 7．选取60株金黄色葡萄球菌和84株对照细菌为训练集，56株金黄 色葡萄细菌和75株对照细菌为验证集，采用SELDI．TOF．MS检测训 练集和验证集细菌蛋白指纹图谱。利用BiomarkerWizard软件筛选金 黄色葡萄球菌特征性蛋白，通过BiomarkerPattems软件建立金黄色 葡萄球菌决策树诊断模型。8．利用验证集中56株金黄色葡萄球菌和 75株对照细菌蛋白指纹图对建立的诊断模型进行盲法验证。 结果 1．四种DNA提取方法中，只有改良NaOH方法能成功提取金黄色葡 2 ’ ．” ● ， 一 J● 萄球菌DNA。2．所有金黄色葡萄球菌均能扩增出16SrDNA，PCR扩 增产物测序结果与GenBank的金黄色葡萄球菌序列比对，相似性均 多个酶切位点，tuf基因经过AIM，HinfI酶切的产物具有特征性，可 将不同的葡萄球菌区分开。实验发现，在优化的PCR反应条件下， 不同的葡萄球菌均能扩增出668bp的产物。PCR产物经过彳，以，HinfI 酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果显示，酶切结果与理论相符，并能区分 金黄色葡萄球菌。4．不同激光强度下，细菌蛋白指纹图谱略有差异， 以激光强度为190检测结果最佳。5．金黄色葡萄球菌经培养24h、48h、 达有一定影响，同时也发现有多个蛋白标志物在不同时间均稳定表 达。6．金黄色葡萄球菌重复检测20次，6个特征蛋白峰的分子量变异 很好的重复性。7．SELDI．TOF．MS检测结果显示，所有金黄色葡萄球 000．20 菌均具有相似的蛋