Tca8113肿瘤微环境诱导小鼠髓源性树突状细胞免疫耐受性探究.docVIP

Tca8113肿瘤微环境诱导小鼠髓源性树突状细胞免疫耐受性探究【中图分类号】R73【文献标识码】 A【文章编号】1672-3873（2011）03-0019-03 【摘要】目的：tca8113肿瘤微环境诱导骨髓CD34+细胞分化为免疫耐受树突状细胞体外实验研究。方法：利用无菌小鼠长骨骨髓细胞，对照组在常规重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白介素-4（rmIL-4）培养液中培养，诱导分化为DCs，实验组在培养样体系中再加入舌鳞癌细胞株培养上清液，对照组不加任何干预因素。培养六天后加入（LPS）观察其对外源性刺激的反应,流式细胞术检测DCs表型CD86、CD11C、MHC-Ⅱ表达，混合淋巴细胞增殖实验比较其在体外刺激T淋巴细胞增殖能力。结果：tca8113肿瘤微环境不能抑制DCs成熟；tca8113-DC和LPS+tca8113-DC MCH-Ⅱ表达高于DC 和LPS+DC，p0.05; tca8113-DC刺激T淋巴细胞增殖的能力弱于对照组， p 1.4.3 树突状细胞培养 将收集到的小鼠骨髓细胞以含10μg/ml rmGM-CSF+10μg/ml rmIL-4的10％胎牛血清RPMI1640培养液配成2×109/L骨髓细胞悬液，6ml/瓶接种于50ml培养瓶。将其分为实验组（tca8113-DC）：培养体系中再加入含 cs-Tca8113 1.4ml；对照组（DC）：不加任何干预因素。所有细胞置37℃、5％CO2，饱和湿度条件下培养48h换液，仅保留贴壁细胞，同时再加入培养液实验组加入含培养液6ml；实验组再加入1.4mlcs-tca8113；之后隔日半量换液，实验组额外补入3ml培养液+0.7ml cs-Tca8113；培养至第六天收集悬浮细胞计。每组取1/3细胞送流式细胞仪检测，每组剩余2/3细胞10％胎牛血清RPMI1640 4ml重悬后接种于20ml培养瓶，同时加入LPS至10μg/ml，继续所有细胞置37℃、5％CO2，饱和湿度条件下培养24小时后，收集各组悬浮细胞（LPS+DC、LPS+tca8113-DC），送流式细胞仪检测及混合淋巴细胞反应。 1.4.4 DCs表型CD11c、CD86、MCH-Ⅱ检测 于培养第六天收集各组悬浮细胞部分送流式细胞仪检测，部分细胞加入LPS培养24小时后送流式细胞仪检测 1.4.5 混合淋巴细胞反应 制备C57BL/6小鼠脾细胞悬液，用淋巴细胞分层液李显获得单核细胞，尼龙毛刷吸附获得T淋巴细胞，与经50微克/ml丝裂霉素C灭活的各组DC（2×105/孔）以不同浓度梯度混合培养与96孔原地细胞培养板中（含10％胎牛血清RPMI 1640培养液），并设置阴性对照和无细胞空白对照，混合培养48h后在待测空中加入MTT液（5mg/ml），4h后吸去培养液和MTT混合液，加入DMSO液150 ul，酶标仪检测每孔OD值，波长设为570nm。刺激指数(SI)=（各测试孔OD值 -空白对照OD平均值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值） 1.5 统计学处理 实验数据均以#63426;±s表示，两组数据的比较采用t检测，所获得数据用统计软件SPSS 13．0分析，计算P 值, P 0.05，说明肿瘤微环境不抑制骨髓CD34+细胞分化为DCs；tca8113-DC、 LPS+tca8113-DC MCH-Ⅱ、DC 和LPS+DC 组MCH-Ⅱ+CD86 表达无统计学意义 p0.05,说明肿瘤微环境不抑制DCs 成熟；对照组DC经LPS刺激前后,MCH-Ⅱ+CD86表达增加 p0.05，说明tca8113-imDC具有抵抗成熟能力。见表1. 肿瘤微环境抑制髓源性小鼠树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖能力 对照组DC刺激T淋巴细胞增殖SI=2.86±0.29,，经LPS刺激后LPS+DC诱导T细胞增殖活性明显提高SI=4.02±0.09 p [4]Alessandro P, Maria RZ .Mechanisms of tumor escape: role of tumor microenvironment in inducing apoptosis Of cytolytic effector cells[J].Arch Immunol Ther Exp,2006,54:323-333. [5]Inaba K，Pack M，Inaba M，et a1．High levels 0f a major histocompatibility complex Ⅱ-self peptide complex on dendritic from the T cell areas