针对TGF-β1腺病毒siRNA制备和对模型大鼠肺间质纤维化影响.pdf

中文摘要 针对TGF．p腺病毒lsiRNA的制备及对模型大鼠肺间质纤维 化模型的影响 博士研究生： 刘绍霞 导 师： 张国俊教授 郑州大学第一附属医院呼吸内科郑州450052 中文摘要 肺纤维化是一组以肺问质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变的疾病， 发病机制迄今尚不十分清楚，主要涉及到多种炎症细胞、免疫细胞及其分泌的 介质和细胞因子，在炎症反应过程中出现免疫调节紊乱、氧自由基损伤、胶原 代谢失衡等。早期病变基础是急性肺泡炎，在肺泡炎形成过程中多种炎性细胞、 免疫效应细胞活化，分泌大量细胞因子，某些细胞因子如肿瘤坏死因子．Q(tunor necrosis 1(transforminggrowth factor-alpha，TNF．Q)和转化生长因子．B factor-beta1，TGF．131)，它们在组织损伤和修复中发挥了重要的作用。因其病 因复杂，临床上缺乏有效的治疗手段，所以预后极差。疾病后期为大量的成纤 维细胞的病理性增殖及细胞外基质的进行性聚集，逐步取代J下常的肺组织结构， ofthefor 出现限制性通气功能障碍、肺一氧化碳弥散量(diffusingcapacitylung carbonmonoxide，DLco)降低，最终导致呼吸衰竭而死亡。近年来，肺问质纤 维化疾病的发病率和病死率呈逐年递增的趋势，给患者及社会带来了极大的危 害。 机体大多数组织和细胞都可以产生TGF．131，如淋巴细胞、巨噬细胞、肥大 细胞、粒细胞、血小板、气道上皮细胞和成骨细胞等。TGF．p1是一种多效性细 胞因子，其生物学功能包括调控胚胎的发育、调节细胞的增殖和分化、调节免 疫应答、减轻炎症反应、参与组织的损伤修复和调节细胞外基质的产生和降解 等。已有的研究结果显示，在肺问质纤维化的形成及发展的过程中，TGF．131水 中文摘要 平显著升高，经用糖皮质激素或抗TGF．131治疗后肺间质纤维化的病理程度明显 减轻；敲／出TGF．p1基因可明显减轻小鼠博来霉素诱导的肺纤维化。因此，TGF．p1 被认为是肺间质纤维化形成和发展过程中的最关键的“开关性”细胞因子。目 前，TGF．13 1在肺间质纤维化中的作用已被众多实验证实，通过阻断TGF．B1的产 生或抑制其生物活性能够有效地抑制肺纤维化的发生发展，提示干扰TGF．B1可 能是抗肺纤维化治疗较为理想的手段。 为了更进一步证实TGF．131在大鼠肺间质纤维化模型中对疾病进展的延缓作 用，本研究首次采用RNAi技术及动物实验，对TGF．Bl在肺间质纤维化中的作用 siRNA腺病毒 进行了全面、系统的研究，得出如下结论：成功构建针对TGF．pl 表达载体并包装得到腺病毒颗粒，并在细胞水平证实其干扰效果；然后用气管 内滴入博莱霉素的方法建立大鼠肺间质纤维化模型；通过鼻腔滴,N．TGF．131 siRNA腺病毒干预后，肺间质纤维化程度明显减轻；干预后支气管肿泡灌洗液及 外周血@TGF．Bl的表达水平不同。该研究旨在为以TGF．131为靶点的肺问质纤维 化的分子靶向治疗提供新的思路和可行性的临床依据。 第一部分沉默TGF．pl基因表达的siRNA腺病毒制备及效果分析 方法 000660)序列，使用Clontech公司的RNAi OOTGF．131的基因(NM Designer软件， 设计出针对TGF．B1的siRNA的特异性靶序列和无关对照序列。 siRNA的构建：将上述设计的序列在一定条件 (2)pSIREN．Shuttle．TGF．131 下退火，利用T4 pSIREN．Shuttle．siTGF和pSIR