基于离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究.docVIP

　　基于离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究 结合珠蛋白( haptoglobin，Hp) ，又称触珠蛋白，于1938 年由两名法国人Polonovski 和Jayle 首次发现。Hp 是血清alpha;2 球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，主要由肝脏合成，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及体液中。Hp 作为急性期反应蛋白，当炎症、感染、创伤、恶性肿瘤等发生时在血液循环中水平会升高4 ～ 6 倍，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用。Hp 在人血浆中含量较丰富，正常血浆水平可达0. 3 ～ 2 g /L。人Hp 主要存在3 种表现型，即Hp1-1，Hp2-1，Hp2-2。Hp 基本结构为四聚体，由两条beta; 链和两条alpha; 链( alpha;1 链或alpha;2 链) 组成，beta; 链相对分子质量( Mr) 约为40 103，alpha;1 链约为9 103，alpha;2 链为17 103。其中，Hp1-1 由2 条beta; 链和2 条alpha;1 链组成;Hp2-1 由2 条beta; 链，1 条alpha;1 链和1 条alpha;2 链组成;Hp2-2 型由2 条beta; 链和2 条alpha;2 链组成。由于alpha;2链有一个特殊的巯基，可形成二硫键，形成大分子量的聚集体，如单体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体甚至更大的聚集体。所以这些聚集体主要存在于Hp2-1 和Hp2-2 中，而Hp1-1 主要以单体的形式存在。Hp 主要功能是与游离的血红蛋白( hemoglobin，Hb) 结合并促使其从循环系统清除。在慢性贫血、输血反应或烧伤等急性情况下，Hp 能与红细胞溶解释放出的游离Hb 结合，形成复合物，促使游离Hb 被机体清除，避免对肾脏的损伤。此外，Hp 还具有抗氧化、抑制前列腺素合成、保护一氧化氮、免疫调节等功能，因此具有重要的医用价值。早在1985 年，日本就批准Hp 浓缩制剂用于临床，主要用于治疗烧伤、烫伤、输血、体外循环心脏直视术等引起的溶血反应伴血红蛋白血症或血红蛋白尿等。Cohn 组分Ⅳ是低温乙醇法生产白蛋白过程中产生的一种副产品，富含许多具有药用价值的蛋白，如白蛋白、转铁蛋白、alpha;1-蛋白酶抑制剂、Hp、抗凝血酶Ⅲ等，但在工业生产中一般被废弃，造成严重的资源浪费。本研究以血浆蛋白生产过程中的Cohn 组分Ⅳ为起始原料，采用利凡诺与硫酸铵沉淀组合的前处理方法，后续又采用离子交换层析的方法成功分离纯化Hp，为进一步建立简单易行的Hp生产工艺奠定基础，有助于提高Cohn 组分Ⅳ的综合利用率。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 　　Cohn 组分Ⅳ溶解液( 华兰生物工程股份有限公司惠赠) ; 人血红蛋白( 实验室制备) ; 离心机( Heraeus 公司，型号: Biofuge Prime R) ; 超滤系统( 北京旭邦膜设备有限责任公司，型号: UF-30K) ; QSepharose Fast FloageQuant 350) ( 均GE 公司) ; 层析柱( 25 mm 40 cm，上海康华生化仪器制造公司) ; 垂直电泳仪( Bio-Rad 公司，型号: mini-PROTEAN Tetra) 、转印仪( 北京六一生物科技有限公司，型号: 40D) 、水浴锅( Pharmacia Biotech 公司，型号: MultiTemp Ⅲ) 、兔抗-Hp 抗体( 博士德生物公司) 、HRP 标记的山羊抗兔二抗( 中杉金桥) ，BCA蛋白含量检测试剂盒( 鼎国昌盛生物技术公司) ，其他试剂均为国外或国产分析纯。 　　1. 2 Cohn 组分Ⅳ前处理 　　将Cohn 组分Ⅳ溶解液200 ml 用醋酸铵溶液( 0. 05 mol /L pH 8. 5) 600 ml 稀释至蛋白浓度约为50 mg /ml( BCA 法测定) ，调pH 为8. 5，然后加入2%利凡诺至终浓度8 mg /ml( 约532 ml) ，室温搅拌20 min，4 ℃静置2 h，弃沉淀，收集上清。加入活性炭吸附，并用滤板过滤，收集滤液调pH 为7. 0。加入硫酸铵至50% 饱和度( 约344 g) ，室温搅拌20 min，4 ℃ 静置30 min。然后4℃，8500 g 离心30 min。取沉淀并溶于500 ml NaAc-HAc( 0. 05 mol /LpH 5. 5) 缓冲液中，进行超滤脱盐( 截留相对分子质量为30 103 ) ，即为前处理样品。 　　1. 3 Q Sepharose Fast Flool /L pH 5. 5) 平衡Q Sepharose Fast Flo 2. 5 cmI. D，CV = 30 ml) ，流速为10 ml /min。将