海珠益肝胶囊对免疫性肝损伤小鼠神经肽SP VIP及辅助性T细胞亚群影响.docVIP

海珠益肝胶囊对免疫性肝损伤小鼠神经肽SP VIP及辅助性T细胞亚群影响摘要：目的：观察海珠益肝胶囊对免疫性肝损伤小鼠神经肽SP、VIP及辅助性T细胞亚群的影响。方法：应用尾静脉注射卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)建立免疫性肝损伤小鼠模型，分离小鼠淋巴细胞，经佛波醇乙酯(PMA)、离子霉素、莫能茵素刺激培养6h后，收获细胞，利用细胞内细胞因子染色流式细胞术检测Th1／Th2比例：采用放免法检测血浆和脑垂体中SP、VIP含量。结果：在模型组，外周血和脑垂体中SP含量较正常组逐渐增加，VIP含量较正常组逐渐降低，第18天、25天与正常组比较有显著性差异(P0.05)；Th1细胞的百分率逐渐升高，Th2细胞的百分率逐渐降低，Th1／Th2的比值增大，与肝组织损害程度呈现正相关：海珠益肝胶囊能够降低外周血和脑垂体中sP含量，增加VlP含量，与模型组第25天比较有显著差异(P0.01)，能够恢复sP与VlP的平衡；降低Th1细胞的百分率，恢复.Th1／Th2的比例，对肝组织损害具有保护和改善作用(P0.05)。结论：在小鼠免疫性肝损伤过程中，存在sP与VIP的分泌紊乱及Th1／Th2细胞失衡，海珠益肝胶囊能够恢复SP／VIP、Th1／Th2细胞的平衡，对肝组织损害具有保护利改善作用，可能是其免疫约理机制之一。 关键词：海珠益肝胶囊；P物质(SP)；血管活性肠肽(VIP)；Th1细胞；Th2细胞；流式细胞术；免疫性肝损伤 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2007)11―2267―03 慢性乙型肝炎主要损伤器官在肝脏，同时伴有肝外表现：如神经病变、内分泌失调、免疫功能紊乱等，在神经系统、内分泌系统、免疫系统均存在病理变化。中医药治疗疾病的优势就在于从整体上着眼于各种因素引起的机体反应状态，改善多个系统的功能失调，消除病理产物的复合刺激，纠正病理偏颇，恢复内稳定，恢复阴阳平衡。笔者应用尾静脉注射卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)建立免疫性肝损伤模型，探讨海珠益肝胶囊对免疫性肝损伤小鼠神经肽SP、VIP及辅助性T细胞亚群的影响。 1　材料与方法 1.1　实验动物6周龄SPF级雄性昆明小鼠48只，体重(22±2)g，由湖北省医学科学院实验动物中心提供，正常饮食。 1.2　药物与试剂海珠益肝胶囊由叶下珠、海藻等中药组成，由湖北省中医院药剂科按要求配制成浓度为100％的药液分装，灭菌，4℃保存，地塞米松片(浙江仙琚制药有限公司)用生理盐水配成浓度为0.02％的溶液。0.9％生理盐水(武汉滨湖制药厂)，冻干卡介苗(北京天坛生物制品股份有限公司)，PMA、离子霉素、莫能菌素(Alexis Bio-chemicals公司)，脂多糖、多聚甲醛、皂素(Sigma公司)，RP-M11640培养基(美国Bibco／BRL)，胎牛血清(三利生物制品厂)，PE―anti―mOUSe(CD4)(克隆号GK1.5)、FITC―anti―mouse IFN_―y(克隆号XMG1.2)、HTC―anti―mouse-IL-4(克隆号BVD6―24G2)、小鼠lgG1―FITC／IgG1―PE(克隆号MCGl)(Ebioscience公司)，小鼠淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物医学工程研究所)。sP、VIP放免试剂盒(第二军医大学神经生物学教研室)，r放射免疫记数器(中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司)。 1.3　动物分组与处理随机分为正常组、模型组11天、18天、25天，海珠益肝组、地塞米松组6组，每组8只。模型组、海珠益肝组、地塞米松组于实验第1天尾静脉注射BCG200mg／kg(约5×107活菌／鼠)，第10天尾静脉注射LPS0.4mg／kg(约10μg／鼠)。正常组与模型组灌服生理盐水30mL／kg，每日1次。海珠益肝组灌服海珠益肝30mL／kg，地塞米松组灌服地塞米松30mL／kg，每日1次，连续25天。模型组在11、18、25天分别取8只小鼠眼眶采血，取肝，处死小鼠，正常组、海珠益肝组、地塞米松组在第25天眼眶采血，取肝，处死小鼠。 1.4　sP VIP的检测 小鼠眼眶采血置入已加肝素抗凝剂的干燥管中，加入抑肽酶，离心后分离血浆，-80℃保存。小鼠取血后，脱颈处死小鼠，立即用外科剪剪去头颅骨被盖处皮毛，暴露出头盖骨，小心用外科剪从颅骨中缝将顶骨、额骨轻轻掀起，暴露出大脑半球、小脑、脑干及颈部脊髓，用眼科剪从脑干与颈部脊髓连接处横断，用显微镊轻轻夹住小鼠脑干，缓慢掀起，暴露出小鼠脑髓的底面，在颞叶与脑桥交界处，可见垂体窝内的脑垂体，取下脑垂体，置于装有0.5mL生理盐水的EP管中，煮沸3min后，加1mol／L冰酣酸0.2mL EP管中，用小玻棒将脑垂体