第9章原生质体的培养与体细胞杂交.pptVIP

第二节 体细胞杂交 一、体细胞杂交概念及意义 1、体细胞杂交概念 即原生质体融合，使分离下来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，像性细胞受精作用那样相互融合成一体。 ◆使植物无性杂交成为可能 ◆使有性杂交根本无法获得的种间、属 间、科间远缘杂种成为现实 ◆打破了物种间的界限 2、原生质体融合的意义 （一） 原生质体融合的类型 原生质体融合可以分为 自发融合 诱发融合 二、原生质体融合的类型及过程 1、自发融合 由于去壁的裸细胞具有彼此融合的能力，在制备原生质体的酶解保温处理过程中，相邻的原生质体能彼此融合形成含有多个细胞核的融合体，这种方式就是自发融合。 仅限于同一物种内。 2、诱发融合 通过诱发剂是两个彼此相邻的原生质体相互融合的过程，称为诱发融合。 ◆融合时可能出现的融合形式： A、异核体或异核细胞（细胞质融合，细胞核没有融合） B、杂种原生质体或合子细胞（双核异核体的细胞核融合产生的） C、同核体（相同原生质体融合产生） D、非对称杂种或细胞质杂种 ◆诱发融合的主要方式有 化学融合方法 物理融合方法 彩叶芋 （1）化学融合 采用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合。常用的化学融合剂主要有PEG、NaNO3等。 ◆PEG融合的机理： PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。 当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动性作用，引发原生质体的粘连。 当PEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体融合。 ◆PEG具有一定毒害作用 ◆PEG的使用浓度范围在25% ~ 40% （2）物理融合 采用电场等方法使原生质体相互靠近、融合的方法。 ◆电融合： 指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。 ◆电融合特点： 效率高 对原生质体伤害性小 对融合细胞数易于控制 * * * * 第九章 原生质体的培养与体细胞杂交 第一节 原生质体的培养 第二节 体细胞杂交 第一节 原生质体培养 ■原生质体培养目的 A、实现远缘物种的体细胞杂交 B、外源染色体、DNA或细胞器的导入，创造新远缘杂种 ■原生质体培养的全部技术环节 A、原生质体分离 B、原生质体培养 C、体细胞杂交 D、杂种细胞产生愈伤组织 E、再生植株 一、原生质体的概念 1、原生质体 是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的 原生质团。 ◆无细胞壁 ◆具有活细胞的特征 2、原生质体培养 指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。 二、原生质体培养的意义 三、原生质体的分离方法 1、机械分离法 采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。 特点： ◆原生质体产量很低 ◆方法繁琐费力 ◆局限性大 2、酶法分离 采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。 特点： ◆操作简单 ◆分离效果好 ◆细胞基本可保持完整性 四、原生质体纯化与活力测定 a、离心沉淀法 应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。 1、原生质体的纯化 b、漂浮法 ◆用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面； ◆通过网筛过滤、离心、收集沉淀； ◆用蔗糖液洗涤离心2—3次，漂浮收集。 c、界面法 选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。 叶肉原生质体分离纯化 a、形态识别 形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。