神经生物学常用研究方法2012.pptVIP

讲授提纲 组织材料的处理 一般染色方法 免疫组织化学 原位杂交 神经细胞培养 I 组织材料的处理 1.固定(fixation) 目的： 防止组织自溶，保护组织免受微生物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失，维持组织结构使之正确的反应生活状态。 固定剂：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定 2.切片(section)： 石蜡切片，冰冻切片 II 一般染色方法 一、尼氏染色方法(Nissl staining)： 1. 定义： 是用碱性染料染神经组织的一种方法，神经组织中可与碱性染料结合的主要成份是核酸，神经元胞体中有大量核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在。细胞核中染色质少，故染色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核中染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜下尼氏小体是许多规则平行排列并相互够通的粗面内质网以及其间的游离核糖体组成。 二、高尔基技术(Golgi technique) The Golgi (and related) methods work by staining tissue with silver nitrate which is then reduced to silver. This produces uniform dark coloring of the whole neuron . The morphology of dendrites and axon can be studied in detail. cerebral cortex 三、神经束路示踪 1.定义： 利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。 2.示踪剂： 辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP ） 生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA） 神经生物素（neurobiotin） 核黄（nuclear yellow） 荧光金（fluorogold） 固蓝（fast blue） （一）HRP Tracing Experiment 1.HRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法 2.Survial time：（束路长度 毫米/350毫米）+1日 3.Fixation and Section 4.Incubation Procedure: a.wash sections briefly in three changes of PB b.move the sections to the incubating medium (0.2%DAB,1%H2O2) kept at room temperature for 30-40min. c.wash three times in PB for stop the reaction. d.mounting and observation. （二）荧光染料示踪法 1.荧光染料的配制： 2.荧光染料的注射： 3.动物存活期：一般存活2-4天。 4.灌注固定、取材、冰冻切片。 5.贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪 色，贴片后应立即观察。 Rat facial motoneurons revealed with three neuronal tracers, blue - fast blue, red - dextran rhodamine, yellow - fluoro gold 四、NADPH-diaphorase组织化学染色法 1.NO(nitric oxide)的生物合成： 催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶（NO synthase, NOS), NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧为底物，消耗1.5mol NADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。 NADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate Diaphorase:黄递酶 在神经系统大部分区域NADPH-d组织化学染色和NOS免疫组织化学染色一致。 2.NOS与 NADPH-d活性的比较 Nos活性： a.协同因子有Ca2+、CaM、NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都可抑制Nos b.底物:L-Arg NADPH-d活性: a.不需CaM、Ca2+作为协同因子，只需NADPH b.底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝） 3.NADPH-d组化染色步骤 a:冰冻切片b:0.05M Tris缓冲液漂洗c:于含0.2%Tritonox-10