人α1胸腺素基因克隆及表达载体构建.docVIP

人α1胸腺素基因克隆及表达载体构建摘 要 目的：为人α1胸腺素基因的蛋白质表达奠定基础。方法：用Trizol法提取人α1胸腺素RNA反转录成cDNA，以已知胸腺素基因为模板，在编码区上游和下游分别设计合成一对含有EcoRI和BamHI酶切位点的寡聚核甘引物扩增Tα1克隆到PUC19载体中，双酶切后回收连接到表达大肠杆菌DH25中表达。以碱裂解法提取重组质粒双脱氧链法序列测定。结果：成功构建了Tα1克隆重组体PUC19-Tα1，经序列分析证实对码序列无误。结论：Tα1在 DH25中表达成功。 关键词 胸腺素 基因 克隆 表达 资料和方法 材料：①DH25为中科院微生物所保种，PUC19购自Promega公司，酵母菌、蛋白胨系OXOID公司产品。②主要试剂 Trizol和REMI1640购自Gibco公司。Taq聚合物、T4DNA酶为MBI公司，EcoRI、BamHI、TEMED购自宝令曼公司。AMV及baffer购自Pharmacia公司。MarksPBR322DNA/HaeⅢ购自华美生物工程公司。FCS为Hyclone公司产品。琼脂糖、丙烯酰胺N，N’-亚甲基丙烯酰胺为Promega公司产品。Alkalnie Phospllatase、RT-PCR试剂盒为Promega公司产品。 胸腺上皮细胞（TEC）培养：取5个月引产胎儿，无菌条件下取其胸腺，以PBS净去包膜与RBC，将其剪成1mm?3以下组织块，以PBS冲洗2次，再用REMI1640洗涤2次，弃液后平铺于50ml培养瓶壁上。每瓶2～3块。加入REM1640（含10%FCS）细胞培养液3ml（加入量以组织块不浮起为限），放37℃5%CO?2体积浓度条件下培养，24小时后换液，以后隔日换液1次。 RNA提取与测定：①收集14天的人胎胸腺上皮细胞，经PBS洗涤后，以REMI1640调成细胞数为5×10?6/ml移入Eppeudorf 管中，加入1ml的Trizo1试剂，余下步骤按照试剂盒说明书提供程序进行。待真空干燥，去除样品中的乙醇-20℃保存，以适量DEPC处理水溶解沉淀30μl，测定OD值与 RNA纯度。②RNA测定：取3μl已提取的总RNA加入比色杯中，用 DEPC水稀释至300μl进行比色，分光光度计为Pharmacia测定260nm和280nm吸光度。结果：A260/A280=1.88，RNA含量为6.9μg/ml×100。③鉴定电泳：以1%甲醛变性胶为凝胶板，0.5×TBE为电泳缓冲液。吸2μl RNA上样缓冲液，离心混匀上样6U/cm?2电泳2小时。结果：暗室紫外灯下可见18S与28S的2条RNA条带。 引物设计：根据已知人α1胸腺素基因序列使用计算机设计一对引物，使上下游引物分别含有EcoRI和BamHI酶切位点。上游引物P1：5′CGGAATTCCATATGTGAGACGCAGCCGCAG3′。下游引物：5′CGGGATCCTAGATTTTCTGCCTCTTCCACC３′。 RT-PCR：①逆转录：在微量离心管中依次加入RNA10μg10×Baffer 5μl（0.5mol/L，pH7.6，Triscl 0.7mol/L，KCl 0.15mol/L，MgCl?2 0.1mol/L，DTT2U），5mmol/d，NTP混合物10μl，引物P1 2μl，引物P2 2μl，RNA抑制酶25U，AMV 2μl（20U）加DEPC水至50μl，混匀放42℃温浴2小时。②扩增：取0.5mlEppeudorf 管依次加入上述逆转录产物0.2μl，10×Baffer 5μl，2.5mol/L，Dntp 5μl混匀，放入PE9600 PCR扩增仪。扩增条件：预变性94℃3分钟，然后按94℃２秒、53℃２秒、72℃１５秒，循环扩增30次，最后一次延伸72℃7分钟，扩增结束。扩增产物用1.8%琼脂糖电泳，以PBR 322DNA/HaeⅢ为分子量标识鉴定扩增产物，并将阳性条带切胶洗脱乙醇，沉淀后-20℃保存。 重组Tα1DNA克隆载体的构建与表达：①将PUC19质粒和PCR扩增的Tα1DNA片段分别用EcoRI和BamHI进行双酶切，电泳回收DNA片段，经过酚、氯仿抽提后-20℃冻存用于连接。②连接：目的基因小片段5μl载体1μl，10×Ligase Baffer 10μl，T4DNA Ligase 1μl（3U）超纯水11μl混合后16℃连接过夜。③转化：取连接物10μl及减法制备的大肠埃希菌DH25混合，经冰上冷置和42℃热击90秒后，取20μl涂AMP平板，37℃培养过夜进行蓝/白菌落筛选。挑出白色菌落再（扩增）培养，以碱裂解法提取质粒DNA,进行酶切、电泳与序列测定。 结 果 以10%琼脂糖电泳在100bp处