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乌药精颗粒中粗多糖检测方法探析关键词 乌药精颗粒 粗多糖 检测方法 多糖在调节血脂、免疫功能及抗疲劳、抗肿瘤、抗放射等方面具有显著的作用[1-3]。目前国内尚无标准方法测定多糖的含量[4],本法采用糖化酶消化,80%乙醇沉淀,用苯酚-硫酸反应法测定含量。测定结果稳定、准确,适用于含糊精保健食品中粗多糖含量的检测。 1 实验材料 1.1 实验试剂:①葡萄糖标准液:准确称取105℃干燥恒重的葡萄糖标准品0.5000g,加水溶解后,定容至50ml,此液含葡萄糖10.00mg/ml。②葡萄糖标准应用液:吸取以上标准液1.0ml,加水定容至100ml,此液含葡萄糖0.10mg/ml。③50g/L苯酚溶液:称取新鲜苯酚5.0g,加水至100ml溶解,放置冰箱中。④糖化酶:250g/瓶,活性10万/g,批号:080318,上海蓝季科技发展有限公司生产;⑤乌药精颗粒:由天台乌药、西洋参、黄精、刺五加等组成,为棕黄色粉末,样品批号分别为071210、071215、071220。1号样品(上述中药提取物干燥粉末0.7g,葡萄糖1.3g);2号样品(与乌药精颗粒配方相同,含中药提取物干燥粉末0.7g,糊精0.9g,葡萄糖0.4g);3号样品(含糊精、葡萄糖各1g)。由浙江天台山乌药生物工程有限公司提供。 1.2 主要仪器:UV-1000型紫外可见分光光度计,上海天美科学仪器有限公司生产;DK-600S型三用恒温水箱,上海精宏实验设备有限公司生产;IKA MS3型漩涡混合器,广州仪科实验室技术有限公司生产;GS-6R型离心机,贝克曼公司生产。 2 实验方法 2.1 标准曲线制备:准确量取葡萄糖标准应用液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml(相当于葡萄糖0.0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg),分别置于25ml比色管,准确加水至2ml,加入苯酚溶液1.0ml,浓硫酸10ml,混匀,沸水浴2min,冷却至室温,485nm处1cm比色皿测定吸光度,绘制标准曲线。 2.2 样品处理和测定:①准确称取混合均匀的样品2g,置于100ml的容量瓶中,加水80ml左右,在沸水浴中加热2小时,冷却至室温,过滤。加1.0ml 10%的糖化酶溶液(含1万U/ml,现配现用,在离心机中以3000rpm离心20min后用上清液),加0.5ml乙酸钠缓冲液(PH7.4),加塞,于55～60℃保温2h,中间间歇搅拌,加热至沸(使酶失活)。放冷,定容至100ml,过滤。②取5ml溶液至50ml的离心管中,加20ml无水乙醇,在离心机中以3000rpm离心20min,并小心弃去上清液,再用10ml 80%乙醇洗沉淀物,在离心机中以3000rpm离心20min,反复操作3次。残渣(沉淀物)用蒸馏水溶解并定容至50ml。此溶液为样品测定液。③取2.0ml样品测定液于25ml比色管,加入苯酚溶液1.0ml,浓硫酸10ml,混匀,沸水浴2min,冷却至室温,485nm处1cm比色皿测定吸光度,查标准曲线得样品液中葡萄糖含量。④同时做糊精对照(样品由糊精、葡萄糖各1g组成),如果糊精对照测定结果,粗多糖含量不在0.2%以下,说明酶活性不够,应增加用量重新检测。 2.3 结果计算:X(%)=m1×v1×v3×100/(m2×v2×v4×1000)。X为指样品中粗多糖的含量(以葡萄糖计)(g/100g);m1为(标准曲线查)样品测定液中葡萄糖的质量(mg);m2为样品的质量(g);V1为样品定容体积(ml);V2为用于醇沉的体积(ml);V3为醇沉离心后的定容体积(ml);V4为测定用所取样品测定液的体积(ml)。 2.4 粗多糖测定方法验证:取1号样品、2号样品、3号样品各2g,分别用上述粗多糖检验方法测定样品粗多糖含量,同时用不加酶方法测定样品粗多糖含量。 3 实验结果 3.1 不同批次乌药精颗粒粗多糖检测结果:采用上述检验方法对071210?071215?071220批次的乌药精颗粒样品进行了粗多糖含量检测,结果详见表1。 3.2 不同方法对不同样品的粗多糖含量检测结果:详见表2。 4 讨论 目前保健品中的粗多糖的检验方法是根据《保健食品功效成分检测方法》(王光亚主编,2002年版)和《保健食品化学及其检测技术》(何照范、张迪清编著,1998年版)的多糖检测方法改进。考虑到本品原料中糊精亦有多糖,其中主要为小分子量的多糖,在样品处理时先用酶解将糊精分解为葡萄糖,再乙醇进行沉淀,以去除小分子量多糖,经验证和多次检测,结果较为稳定。 从表2中可知,中药提取物加酶后,其粗多糖测定结果比不加酶有少量下降;而中药提取物加糊精、加酶后,其粗多糖测定结果