乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD+4-CD+8及.docVIP

乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD+4/CD+8及摘 要：目的:观察乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD+4/CD+8及Fas、FasL蛋白表达的影响。方法:采用雌性BALB/c小鼠皮下多点注射小鼠透明带多肽，建立免疫性卵巢早衰模型。将造模成功的小鼠随机分为模型组、己烯雌酚组、六味地黄丸组、乌鳖颗粒大、中、小剂量组。另设正常组和佐剂组，共灌胃给药4周。实验末应用免疫组化法测定脾脏CD+4、CD+8，计算CD+4/CD+8的比值。应用免疫组化法测定卵巢Fas、FasL蛋白的表达。结果:模型组小鼠脾脏CD+4/CD+8比值明显高于正常组和佐剂组（P95% ，由杭州中肽生化有限公司生产，批号：P00035。（9）羊毛脂：上海华亭羊毛脂厂，批号（10）液体石蜡油：广东汕头市光华化工厂，批号（11）液体卡介苗：由上海生物制品研究所提供，批号：200503001。（12）Fas试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：RAB-0022。（13）Fas-L试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：RAB-0199。（14）CD4+试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：MAB-0251。（15）CD8+试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：MAB-0021。（16）即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：KIT-5030。（17）DAB显色试剂：福州迈新生物公司提供。 1.5 试剂配制 （1）弗氏不完全佐剂配制：准确称取40g羊毛脂、80g液体石蜡按1∶ 2的重量比将羊毛脂与液体石蜡置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。（2）弗氏完全佐剂配制：将液体状卡介苗1支(100mg/支)，均匀混入灭菌的弗氏不完全佐剂中，使其含菌浓度为10mg/mL，制成弗氏完全佐剂。 2 实验方法 2.1 免疫性POF模型制备 称取1mg小鼠透明带多肽粉末，加入1mL三蒸水配成溶液，取1mL溶液稀释至6mL溶液，与弗氏完全佐剂按1∶ 1比例配制成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1∶ 1比例配制成免疫强化试剂。正常组每鼠每次免疫时予0.15mL生理盐水皮下多点注射双后脚掌及腹腔。佐剂组每鼠首次免疫时每鼠予0.15mL弗氏完全佐剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔。佐剂组第2、3次免疫时每鼠予0.15mL弗氏不完全佐剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔。其余每鼠取015mL免疫试剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔，14天后以免疫强化试剂每鼠0.15mL皮下多点注射小鼠双后脚掌及腹腔进行第2次免疫，14天后进行第3次免疫\[2\]。 [WT5”FZ〗中华中医药 学刊 2.2 分组及给药 取健康雌性BALB/c小鼠，18～22g，除正常组和佐剂组的20只小鼠外，其余小鼠按上述方法造模，每天定时取阴道分泌物细胞，观察动情周期变化以确定造模是否成功。取造模成功的小鼠随机分为6组，共8组，分别为：(1)正常对照组：等量生理盐水；(2)佐剂对照组：等量生理盐水；(3)模型对照组：等量生理盐水；(4)己烯雌酚组：0.25mg/kg，0.2mL/10g；(5)六味地黄丸组：4.5g/kg，0.2mL/10g；(6)乌鳖颗粒大剂量组：16.5g/kg，0.2mL/10g；(7)乌鳖颗粒中剂量组：8.25g/kg，0.2mL/10g；(8)乌鳖颗粒小剂量组：4.125g/kg，0.2mL/10g。以上各组在第3次免疫后6天按上述剂量灌胃，连续4周，每周休息1天。 2.3 检测指标 2.3.1 小鼠动情周期观察 每天定时取阴道分泌物细胞，观察动情周期变化来确定造模成功与否。 2.3.2 小鼠卵巢Fas、FasL 蛋白表达的检测 实验末取卵巢，剔除脂肪后将卵巢分组浸入10%甲醛溶液中固定。用免疫组化法测定卵巢Fas、FasL 蛋白的表达。 2.3.3 小鼠脾脏CD+4、CD+8的检测 实验末取脾脏，剔除脂肪后将卵巢分组浸入10%甲醛溶液中固定。用免疫组化法测定脾脏CD+4、CD+8的含量，计算CD+4/CD+8的比值。 2.4 统计学处理 统计学处理数据用±s表示，采用t检验，用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。 3 实验结果 3.1 小鼠卵巢Fas、Fas-L蛋白表达的结果 小鼠透明带多肽所致卵巢早衰模型组小鼠卵巢Fas蛋白表达低于正常组，Fas-L蛋白表达明显高于正常组，卵巢Fas、Fas-L蛋白表达、Fas/Fas-L比值与正常组比较具有显著性差异（P0.05，P0.01）。乌鳖颗粒大剂量组、中剂量组小鼠Fas蛋白表达明显高于模型组，与模型组比较具有显著性差异（P0.05，P0.01）。乌鳖颗粒各剂量组Fas-L蛋白表达明显低于模型组