RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF表达及胶原合成影响.docVIP

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF表达及胶原合成影响[摘要]目的：研究结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）siRNA表达载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞（Human keloid fibroblasts，HKFs）中CTGF表达、胶原蛋白分泌的影响。方法：根据RNA干扰(RNA interference, RNAi)设计原则，设计并构建特异性CTGF siRNA表达载体，转染体外培养HKFs。用荧光实时定量PCR分析细胞中CTGF mRNA表达水平，3H-脯氨酸掺入法测定细胞胶原蛋白分泌水平。结果：与质粒组和对照组比较， CTGF siRNA表达载体组的CTGF mRNA表达降低约59.9%（P＜0.05）,胶原蛋白分泌明显下降（P＜0.05）。结论： CTGF siRNA表达载体能明显抑制HKFs中CTGF表达及胶原蛋白分泌水平，有可能成为临床上治疗瘢痕疙瘩的新方法。 [关键词]基因疗法；结缔组织生长因子；人瘢痕成纤维细胞 [中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-03 Impact of RNAi on CTGF expression and collagen secretion in HKFs ZHAO Ping，LI Shi-rong （Department of Plastic Surgery, Southwest of Third Military Medical University, Chongqing400038,China） Abstract:ObjectiveTo study the effect of the constructed vecrors expressing siRNA of connective tissue growth factor(CTGF) on CTGF mRNA level and collagen secretion in HKFs.MethodsVectors expressing CTGF siRNA were designed, constructed andtransfected into HKFs. The real-time fluorescent quantitative PCR（RQ-PCR）was performed to detect CTGFmRNA level. The collagen secretion was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsThe CTGFmRNA level and the collagen secretion of vecrors group were markedly lower than those of plasmids group（both P＜0.05）.ConclusionVectors expressing CTGF siRNA can inhibit CTGFmRNA level and the collagen secretion in HKFs. This may be a new way to treat keloid. Key words: gene therapy；Connective tissue growth factor(CTGF)；HKFs 瘢痕疙瘩（Keloid KD）是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化。其发病机理尚不十分清楚，常严重毁损患者容颜，引发功能障碍，是整形外科领域的治疗重点和难点。CTGF是一种重要的促纤维化因子，通过TGF/SMADs途径参与病理性瘢痕的形成，阻断CTGF的产生及其促纤维化效应可能为今后病理性瘢痕的治疗提供了一个新的靶点[1]。本研究旨在构建CTGF siRNA表达载体，转染导入HKFs中，观察其对细胞内CTGF的表达和胶原蛋白分泌的影响，并探讨有关机制，为临床上防治瘢痕疙瘩提供新的途径。 1资料和方法 1.1 主要试剂：质粒pGenesil-1（武汉晶赛生物公司），Dosper脂质体（Roche,德国），DMEM高糖培养基（Gibco,美国），Trizol试剂、SYBRGreenⅠ荧光染料、RT-PCR试剂盒(Invitrogen,美国)，3H-脯氨酸（上海原子能研究所）。 1.2 CTGF siRNA表达载体的构建和鉴定：根据RNAi设计原则，用生物信息学方法在GeneBank中找到CTGF基因编码序列(登录号:NM_001901)，选择编码区内以起始密码ATG后100bp