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eNOS第7外显子894G→T及第四内含子基因多态性及脑梗死关系探究基金项目：韶关市科技局立项项目（韶科卫2010-35） 作者单位：512000 广东省韶关市第一人民医院（罗宁，李文锐，邓彦，谭诚，张玉群）；广东省韶关市粤北人民医院（严文娜） 通讯作者：罗宁 【摘要】 目的 探讨内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS,eNOS）第7外显子894G→T及第四内含子基因多态性在中国粤北地区汉族人群中的分布规律，并研究两组基因多态性与脑梗死（Cerebral infarction,CI）的关系及两种基因的连锁关系。方法 本研究采用病例-对照研究，选择中国粤北地区汉族人群130例健康体检者（对照组）和148例经CT或MRI证实的脑梗死患者（CI组）为研究对象，用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析方法（PCR-RFLP）和核苷酸序列测定技术相结合的分子流行病学研究方法，对内皮型一氧化氮合酶第7外显子894G→T及第四内含子基因多态性进行检测及分析。结果 脑梗死组eNOS基因外显子7处第894位T等位基因频率为10.5%，对照组为5.8%，两组比较差异有统计学意义（P 1 资料与方法 1.1 一般资料 148例脑梗死患者均来自2009～2011年韶关市第一人民医院神经内科住院患者，由神经科专科医生根据详细的神经系统检查，头颅CT或MRI扫描以确诊。另选择130例与脑梗死患者年龄相当的健康体检人员作为对照组，所选样本均为血缘上的无关个体，且排除心脑血管（包括高血压）、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病患者。 1.2 方法 运用聚合酶链反应（PCR）技术扩增内皮型一氧化氮合酶第7外显子894G→T及第四内含子基因目的片段，总反应体积为25 μl，混匀后，分别按以下程序于PE9600型DNA扩增仪扩增目的基因，Glu298Asp：95 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30秒，52 ℃退火45秒，72 ℃延伸45秒，35个循环后再于72 ℃延伸5 min。第4内含子VNTR:94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 1 min，56 ℃退火60秒，72 ℃延伸60秒，30个循环后再于72 ℃延伸5 min。Glu298Asp基因多态性：位点的扩增片断长度为457bp，野生纯合子（ GG 基因型） 用限制性内切酶Ban Ⅱ酶切PCR 产物后，因完全切断形成320bp，137bp 两条片段。突变杂合子（ TG基因型） 因含有G→T 点突变，PCR 产物部分被酶切断，形成457bp、320bp、137bp 三条片段。突变纯合子（ TT基因型） 则因完全不被切断，仅为457bp 一条片段。第4内含子VNTR基因多态性：PCR 产物通过6%聚丙烯凝胶电脉分离，EB 染色，凝胶成像仪显影，可见三种类型产物：（1）单一393bp 基因片段（4 个重复序列），即aa纯合子；（2）单一420bp 基因片段（5 个重复序列），即bb 纯合子；（3）393bp 和420bp 片段各一条，即ba 杂合子。基因序列分析：将PCR产物纯化后，在基因测序仪上测序。血浆纤维蛋白原浓度测定：用比浊法测定。 1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件包和遗传学数理统计方法进行统计分析，采用基因计数计算各组基因型频率和等位基因频率，OR（Odds Ratio）用Woolf修正公式，Hardy-Weinburg平衡吻合度，基因频率统计分析及基因间的连锁不平衡分析均采用χ2检验，确认各种因素对脑梗死的独立危险因素。 2 结果 2.1 病例组及对照组的人口学特征及卒中危险因素对比 病例组及对照组的人口学特征及部分卒中危险因素的对比结果见表1，其中年龄、性别构成、吸烟在两组间差异均无统计学意义（P0.05），高血压、胆固醇、甘油三酯两组间差异有统计学意义（P0.05），说明在中国粤北地区汉族人群中，第7外显子894G→T基因位点及第四内含子27 bpVNTR可能单独作用或和其他位点协同作用对CI的发病产生影响。 但脑梗死的发生与环境、遗传等多方面因素相关，非单一因素所决定的疾病，所以eNOS第7外显子894G→T及第四内含子与脑梗死的相关性研究，还有待进一步扩大研究对象的范围，并建立更为严格的筛选标准，以避免分组、分层不同所造成的影响，加强多基因的连锁相关性的研究。 参 考 文 献 ［1］ Heil SG,De Vriese AS,Kluijtmans LA,et.al.The role of hyperhomocysteinemia in nitric oxide （NO） and endothelium-derived hyperpolarizing fac