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RGD多肽表面修饰生物陶瓷修复骨缺损BMP-2表达[商要]目的：了解精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp,RGD)多肽表面修饰的羟基磷灰石－磷酸三钙(hydroxyapatite－tricalciumphosphate，HA－TCP)修复节段性骨缺损局部骨形态发生蛋白－2(bone morphogenet ic protcin－2，BMP－2)的表达。方法：以骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，MSCs)复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP或单纯材料培养制备组织工程骨，选择60只新西兰白兔，制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型，实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA－TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA－TCP；D组：骨缺损区植入HA－TCP。术后4周取材，行修复区局部BMP－2免疫组化分析。结果：术后4周各组骨缺损区均有新骨生成，修复区局部BMP－2表达水平依次为：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)。结论：RGD多肽表面修饰对以HA－TCP为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。 [关键词]组织工程；表面修饰；骨髓基质干细胞；骨形态发生蛋白 [中图分类号]Q813.1　[文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0737－03 RGD多肽是介导种子细胞与支架材料粘附的多肽链，RGD序列可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面自发形成一分子层，为与受体介导的种子细胞提供特异性位点而促进细胞的粘附和分化。本研究旨在应用RGD多肽对HA－TCP材料进行表面修饰处理，以促进MSCs在其表面的粘附和生长，为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。 1　材料和方法 1．1　材料准备：HA－TCP双相多孔生物陶瓷(四川大学生物材料工程研究中心)含60％HA和40％TCP，孔隙率为50％～70％，孔隙直径为200～500μm。将材料修整为1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸馏水加压反复冲洗，去离子水超声清洗2次，每次30min，高压蒸汽灭菌后备用。将RGD多肽(美国Peptide生物工程公司)溶解于50％乙醇中，浓度为2mmol/L。将材料分别置于带胶皮塞的离心管中，加入RGD多肽溶液，负压抽吸使RGD多肽溶液进入材料孔隙内，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值为7.4的0.01mol/L PBS漂洗至中性，晾干。 1．2　组织工程骨制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r/min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106/ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0.25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含1×10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C和1×10-2mol/L β－磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×106/ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％CO2饱和湿度培养7天。 1．3　动物模型和实验分组：选择3周龄雌性新西兰白兔60只，体重为2.0～2.5kg。动物全身麻醉后，常规消毒双上肢，沿上肢前外侧做纵行切口，长25mm，逐层切开、分离、显露桡骨，于桡骨中上1/3交界处截骨，去除桡骨和骨膜，制造15mm长的右侧肢体桡骨节段性骨缺损模型。实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，每组实验动物10只，其中A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA－TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA－TCP；D组：骨缺损区植入HA－TCP。 1．4　BMP－2免疫组化检测：术后4周标本经4％多聚甲醛固定1周，用10％的EDTA脱钙6周，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，制作厚度为5μm的切片，裱片于APES处理的载玻片上。石蜡切片脱蜡至水，3％tt202浸泡，避光20min，蒸馏水冲洗3min×3次。胃蛋白酶消化37℃15min，PBS冲洗5min×2次，1:20羊血清封闭37℃ 30min。甩去多余血清，加一抗37℃1～2h，PBS冲洗5min×2