现代生物技术在植物检疫中的作用.docVIP

现代生物技术在植物检疫中的作用 摘要：本文阐述了免疫学技术中的酶联免疫法、免疫荧光技术、斑点免疫法、免疫电镜技术、免疫染色标记技术及其他抗体介导的检测方法、核酸技术中的核酸探针、RFLP技术、PCR技术等的在植物检疫中的应用原理及优缺点。 关键词：免疫学技术；核酸技术；植物检疫 随着我国动植物产品进出口贸易的日益增多，传统的检测手段已不能满足植物检疫需要，检疫手段的优化迫在眉睫，近年来在免疫学、分子生物学等领域取得了巨大的进步，为全面优化检疫手段，加快检测速度打下了坚实基础。 1 免疫学技术 1.1 酶联免疫法 自酶联免疫吸附技术问世以来，已日益广泛应用于植物病毒、真菌、MID等的检测之中，如病毒方面，对种子中的大豆花叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、等病毒的诊断和检测；真菌方面，疫霉、腐霉、黑盘菌、等真菌的ELISA试剂盒已被商业化生产，并已广泛应用。利用上述ELISA试剂盒检测大豆根茎组织、土壤悬浮液中的大豆疫霉菌；土壤中大豆疫霉的游动孢子、卵孢子和菌丝；病组织中隐地疫霉；灌溉水中的疫霉游动孢子，效果都很好[1]。 1.2 免疫荧光技术 免疫荧光技术是另一种以抗体为基础的在植物病害检疫中具有重要应用价值的检测手段，现已成功应用于植物组织、种子及土壤中细菌及真菌的检测。利用免疫光技术成功的检测出菜豆萎蔫病菌，并且检测的灵敏度达到4.5×lO4cuf／mL，有效地解决了假阳性反应问题。此外，免疫荧光技术在检测土壤根组织的辣阑疫霉菌丝、土壤中樟疫霉游动孢子、瓜果疫霉游动孢子、叶组织中灰葡萄孢；病土、根组织中芸苔根肿菌休眠孢子；根组织中菌丝的厚垣孢子、组织切片中菌丝均取得了ELISA无法达到的效果。免疫荧光技术具有间接和直接免疫荧光法，其中间接免疫荧光法在实践中用途较广，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微进行检测，如利用免疫光技术可在显微镜下检测出结合有荧光色素抗体的细菌阳性细胞，免疫荧光技术检测的灵敏度一般约为lO3～lO5 cfu／mL，不仅对每个荧光细胞可以记数，而且可以观察有关细胞的形态特征。虽然免疫荧光技术灵敏度高，但在实际使用中存在一定的缺陷，如需要昂贵的仪器，操作费时，并且有时受植物和土壤的自身荧光干扰，特别是在抗原量低时，自发荧光强于特异性荧光，致使观察困难，干扰了这项技术的广泛应用。 1.3 斑点免疫法 斑点免疫法技术是近年发展起来的血清学技术，它是通过酶标记抗体与吸收附于硝酸纤维素膜(简称NC)、尼龙膜或其他支持物上的抗原发生特异性结合，经加底物溶液后在NC膜上形成有色斑点的免疫学方法。目前已被应用于植物病毒、MID的检测之中。同ELISA相似，斑点免疫法也可以分为多种，较常用的有直接法、间接法、双抗体夹心法。斑点免疫法操作简便、快速、能够长期保存，在灵敏度方面也高于DASM-ELISA[2]。斑点免疫技术是一项十分有用的血清学技术，它的一个重要用途是组织免疫印迹，通常可以将组织材料(如切割开的种子)直接与硝酸纤维素膜接触，抗原从组织中释放，并结合于膜上,通过直接法检验或使用辣根过氧化物酶(或碱性磷酸酶)标记间接检测结合于膜上的抗原。由于斑点免疫检测技术具有与电镜观察法同样高的灵敏度，且操作容易、简便，试验本身血清用量少,且可重复利用，一次性检测的样品量大，因此是一种适合检疫需要的快速诊断检测方法。 1.4 免疫电镜技术 免疫电镜技术应用于植物病毒检测始于20世纪60年代，70年代以来发展较快，由于免疫电镜技术快速、准确、省工、省抗体和抗原材料，且制好的铜网以及抗血清的包被铜网均好保存一段时间，并可邮寄，因此该技术已广泛应用于植物病原真菌、病毒、MLO以及类病毒的检测中。免疫电镜技术具有与ELISA相同的灵敏度但比E1ISA更为直观、准确、快速，对于某些难于鉴定的木本植物病毒也可检测。 免疫电镜技术可直接检测感染病毒的组织抽提液(包括显症、未显症、脱毒苗)，除了病毒定性外，免疫电镜技术还可以用在植物粗汁液中病毒粒体的定量分析。此外，免疫电镜技术克服了以往检测MID只能用超薄切片进行电镜观察的缺点，现已能用诱捕法诱捕MLO。免疫电镜技术还可以检测dsRNA，已成功用诱捕法诱捕到被TMV感染的植物中复制型的dsRNA，并利用dsRNA抗学清诱捕到真菌病。可以看出，由于免疫电镜技术的诸多优点，因此该技术成为目前较为理想的检测手段之一[3]。 1.5 免疫染色标记技术 Iin和Langenberg等在20世纪80年代首次将胶体金染色技术成功应用到植物病毒的检测。胶体金染色技术是利用金离子还原后的胶体金与抗体(或A-蛋白)结合形成稳定的抗体(或蛋白)-胶体金复合物，通过