rt-pcr实验设计方案.docVIP

RT-PCR实验设计方案 一、试剂及实验材料准备 PCR管；1mL、200 μL 、20 μL（枪头）；1.5 mL；2.0 mL（离心管）；镊子；无菌水（用0.1%DEPC处理）。 以上材料均需置于盛有0.1%DEPC溶液的小桶中浸泡过夜（至少24小时），再置于灭菌锅121℃高压下灭菌30min以除去RNA酶。 二、实验步骤： 总RNA提取： 取植物叶片组织（或根组织）适量置于已用液氮遇冷处理的研钵中，加液氮用研杵迅速研磨组织，直至磨成粉末状（离心机提前4℃预冷）； 向研钵中加入1-2ml（适量）的RNAisoTM Plus提取液，继续研磨样品至裂解液呈透明状； 将匀浆液转移至2ml离心管，室温静置5min； 12000g，离心5min； 小心吸取上清液，移至新的2ml离心管，加入1/5体积（相对于加入2ml离心管的上清液）的氯仿，剧烈振荡15s，待溶液充分乳化至无分相时，室温静置5min，12000g离心15min； 小心取出离心管（此时离心管分三层），小心吸取上清液至另一新的2ml离心管（注意不要吸入中间蛋白质层）； 重复4、5两步 向上清液中加入等体积的异丙醇，颠倒充分混匀后，在15-30℃（常温）下静置10min；12000g，离心10min，离心管底部出现沉淀； 用75%预冷的乙醇洗涤沉淀2次，7500rpm，4min。凉干一段时间后，用DEPC处理无菌水溶解沉淀，60℃ 水浴10min，得模板RNA（比色测纯度）。 三、RNA定量 将得到的模板RNA用DEPC处理无菌水溶解后，进行定量。 首先打开分光光度计，软件界面选择核酸测量，空白组用DEPC处理无菌水，1连池，空白结束后，测量RNA含量； 取RNA样品40ul，用DEPC处理无菌水补齐至4000ul，即稀释100倍，测得实验数据，分别记录以下数据：230.0nm；260.0nm；280.0nm；A260/A230；A260/A280 RNA纯度鉴定标准： OD260/OD280值在1.9-2.1之间，RNA的纯度较好； ?OD260/OD280值小于1.8，表明蛋白杂质较多； ?OD260/OD280值大于2.2，表明RNA已经降解 逆转录RNA取样量的计算： 计算样品浓度（μg/μl）= A260数值×稀释倍数（100）×40/1000； 根据样品浓度计算逆转录所需RNA量（根据实验经验，RNA总量为0.85μg时 结果最佳。因此，由样品浓度（μg/μl）×逆转录所需RNA量（μl）=0.85μg 四、RT-PCR 4.1 RT过程： 试剂准备dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP mM each）2.Random 6 mers（20um） 3. RNA模板 4. DEPC处理无菌水 4.2操作步骤按以下次序将各成分加入一无菌管中。dNTPmix 1ul Random 6 mers 2ul RNA模板 x（根据定量结果确定） ddH2O 补齐至10ul 4.2.2短暂离心后，PCR仪上变性退火反应 65℃ 5min 冰上速冷 pause 4.2.3在上述离心管中配制下列反应液： 5×PrimeScriptTM buffer 4ul RNase Inhibiter 0.5ul PrimeScriptTM RTase 1ul ddH2O 4.5ul 4.2.4短暂离心（离心力？）后，PCR仪上反应： 30℃ 10min 42-50℃ 30-60min 70℃ 15min 4℃ pause 得到cDNA,-35℃保存； 4.2 PCR过程： 试剂准备模版目的基因引物10×PCR Buffer; Taq酶操作步骤按以下将各成分加入一无菌管中10×PCR buffer??????????????? 2.5 μl 引物1??????????????μl 引物2????????????μl Mg2+ 3.0 ul Taq酶???????????0.5μl dNTPmix 0.5 ul cDNA模版　??