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DNA甲基化PCR引物的设计DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR, BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物。本研究旨在介绍甲基化特异性PCR引物设计的原则及“MethPrimer”设计程序的使用方法和有关注意事项。1　材料与方法1. 1　序列的转换　　DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。1. 2　CpG岛的预测[2]　　哺乳类动物基因组中5% ~10%是CpG(二核苷酸),其中70% ~80%呈甲基化状态,称为甲基化的CpG(mCpG)。CpG的聚集称CpG岛,已知在所有管家基因和一些组织特异基因的5′端调控区均有CpG岛呈高度甲基化,基因组中平均100个bp有1个跨度为0. 5~5 kb的CpG岛。　　“MethPrimer”设计程序默认的CpG岛跨度至少为200 bp,GC含量50%,CpG出现频率0. 6。因此,符合这些参数的区域都默认为CpG岛,我们根据任意1个CpG岛设计引物进行扩增。1. 3　BSP的引物设计原则　　标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。　　DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。1. 4　MSP的引物设计原则[3,4]　　对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3′端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3′末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致GC含量降低,从而引起Tm降低。④2套引物应有相近的Tm值,“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5℃,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。2　结果2. 1　MethPrimer设计的BSP引物　　我们运用人雌激素受体β(ERβ)启动子序列(AF191544)来设计硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR, BSP)引物。首先进入免费在线引物设计程序“MethPrimer”(http: //www. uro-gene. org/methprimer/),点击“Go to MethPrimer”,进入“MethPrimer-Design Primers