DB21∕T2106—2013玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法.docVIP

ICS65.020.01 B 21 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T — 玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法 SSR-based Method to Assay Purity of Maize Hybrid Seed 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由沈阳市农业科学院提出。 本标准由沈阳市质量技术监督局归口。 本标准起草单位：沈阳市农业科学院、大连市农业科学院。 本标准主要起草人：杨双、高红治、李金凤、马东梅、王秋艳、潘菊、刘延斌、李雪、张秋颖、 韩明东、杨璐。 玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法 范围 本。 本 种子纯度 Seed Purity 种子在特征特性方面典型一致的程度，本标准中指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示。 聚合酶链式反应 PCR（Polymerase Chain Reaction） 一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。 简单重复序列 SSR（Simple Sequence Repeat） 由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 分子标记 Molecular Marker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。 引物 Primer 是指一小段单链DNA，与模板DNA上特异序列互补结合后启动PCR反应。 原理 SSR分布于玉米整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行玉米种子纯度鉴定。 仪器设备及试剂 仪器设备 PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；Taq DNA聚合酶（含Mg2+的10倍PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold View染料等。 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 方法步骤 取样 按照GB/T 3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取不少于100粒种子。分别随机取其亲本种子各10粒。 单粒种子的DNA提取 种子浸泡1h后，剥取种胚，置于研钵中，加入1mL DNA提取液，研磨后导入2mL离心管中，剧烈摇动混匀后，12000r离心2min，取上清液600μl移入另一个2mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后于室温下静置2min，然后12000r离心2min，弃上清液，在室温下开盖放置使异丙醇挥发，最后加入200μL超纯水使沉淀溶解，即得到DNA粗提液。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。使用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。 PCR扩增 反应体系 总体积20μL，包括11.4μL超纯水、2μL含Mg2+的10倍PCR缓冲液、1.2μL dNTPs（2.5mmol/L）、2μL SSR引物（2.5μmol/L）、0.4μL Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）、1μL DNA，混匀。 反应程序 94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸5min；4℃保存。 电泳检测 凝胶制作 将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好，用水平仪调平。取4.5%丙烯酰胺胶80mL，加入TEMED 80μL和10%过硫酸铵400μL，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1h以上。 预电泳 待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，80W恒功率下预电泳15min~20min。 变性 在20μL PCR产物中加入4μL 6倍变性上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，4℃冷却10min。 电泳 用洗