DB21∕T2138—2013仿刺参基因识别检测方法.docVIP

ICS67.120.30 B50 备案号： DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T ××××—2013 仿刺参基因识别检测方法 Identification of Apostichopus japonicus gene detection method （本稿完成日期：2013.2.1） 2013 - ** - **发布 2013 - ** - **实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由大连市产品质量监督检验所、大连标准检测技术研究中心提出。 本标准由大连市质量技术监督局归口。 本标准由大连市产品质量监督检验所、大连标准检测技术研究中心负责起草。 本标准主要起草人：杨滴、刘彦泓、刘岑杰、夏元凤、刘紫群、姜俊、于利军、董广彬、郝苗、闵健、李鹏。 本标准于2013年**月**日首次发布。 仿刺参基因识别检测方法 范围 本标准规定了仿刺参基因识别检测方法的术语、定义、缩略语、原理、试剂、主要仪器、试样制备、操作步骤、结果判定。 本标准适用于仿刺参基因识别检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 术语、定义和缩略语 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 仿刺参（Apostichopus japonicus） 为棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯首目、刺参科、仿刺参属的动物，俗名刺参。分布于北太平洋区、包括俄罗斯、日本、朝鲜半岛沿岸以及中国大陆的辽宁、河北、山东、江苏等地，常见于波流静稳、海草繁茂和无淡水注入的港湾内以及底质为岩礁或硬底。 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 Real—time PCR：PCR（Real-time polymerase chain reaction） DNA:（deoxyribonucleic acid） Tris: （tris(hydroxymethyl)aminomethane） CtFAM: 6-羧基荧光素，荧光基团（6-carboxyfluorescein） TAMRA：6-（6-carboxytetramethylrhodamine） 18s rRNA:18s核糖体RNA基因 原理 根据仿刺参线粒体保守基因片段，设计引物及荧光探针。利用实时荧光PCR方法识别仿刺参特异性基因。实时荧光PCR方法是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5＇3＇DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 试剂和主要仪器 试剂 除另有规定外，所有试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T 6682规定的一级水。 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；（Na2EDTA）（HCL）(NaOH)； 苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1）（24+1）3 mol/L乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.2； Tris TE缓冲液Tris0.01mol/L, Na2 EDTA0.001 mol/L,用HCL或NaOH调节pH为8.0。PCR仪； 超净工作台； 消毒灭菌锅； 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计； 高速冷冻离心机； 低温冰箱； 纯水器； 微量进样器。 试样的制备 采样工具（剪刀、镊子、研钵）应经过180℃，2h高温灭菌。称取约100g样品，将样品在研钵中研碎。 操作步骤 DNA提取 苯酚-三氯甲烷法 取0.2g研碎好的样品放入2.0mL离心管，加入400μL TE缓冲液，于65℃水浴中溶解10min，上下颠倒混匀。加入与溶液等体积苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1）10min。12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一个2mL离心管中。加入上清液等体积氯仿+异戊醇（24+1）10min。12000r/min室温离心10min，小心吸取上清液。加入上清液1/10体积乙酸钠溶液、等体积异丙醇，混匀后室温静置10min。12000r/min室温离心10min，弃去上清液。70%乙醇洗涤沉淀2～3DNA。50μL TE4℃保存。 试剂盒法 使用不同的商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进行操作。 DNA浓度和纯度