DB21∕T1977—2012水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法.docVIP

ICS65.020.60 B21 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ XXXXX—2012 水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法 Protocol of the polymerase chain reaction for detecting genetically modified components of Bt gene in rice XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 辽宁省质量技术监督局发布 目次 前言 II 1　范围 1 2　规范性引用文件 1 3　术语、定义和缩略语 1 4　原理 1 5　试剂 1 6　仪器 2 7　抽样与制样 3 8　操作步骤 3 9　结果分析与表述 5 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省质量技术监督局提出并归口。 本标准由沈阳农业大学、辽宁省标准化研究院负责起草。 本标准主要起草人：崔震海、杨立宏、张立军、邱学思、徐正进、李丹莉、樊金娟、阮燕晔、姜宏、朱延姝、汪澈、曹松屹、秦萍。 水稻中转Bt基因成分PCR定性检测方法 范围 本标准规定了水稻中转Bt基因成分的PCR定性检测的原理、试剂、仪器、抽样与制作、操作步骤、结果分析和检测结论。 PCR检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 1194 植物及其产品转基因成分检测抽样的制样方法 SN/T 1943 小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法 SN/T 2102.1 食源性病原体PCR检测技术规范 第1部分：通用要求和定义 术语、定义和缩略语 术语和定义 SN/T 1943的术语和定义适用于本标准。 缩略语 PCR: polymerase chain reaction，聚合酶链式反应，简称PCR。 RBE4 gene：rice starch branching enzyme 4，淀粉分支酶基因。 CaMV 35S：35s promoter from cauliflower mosaic virus，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。 NOS：terminator of nopaline synthase gene，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒胭脂碱合酶（nopaline synthase）基因的终止子。 Bt gene：Bacillus thuringiensis gene 原理 水稻样品经过DNA提取后，针对转Bt基因水稻中外源的CaMV 35S启动子、NOS终止子、Bt基因，以及内源的RBE4基因，设计特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，判断水稻及其制品中是否含有转Bt基因成分。 试剂 除非另有说明，本方法试剂均为分析纯试剂和重蒸馏水。 琼脂糖 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液 1 mol/L Tris-HCl溶液(1000 mL) 称取121.1 g Tris溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至7.5，加水定容至1000 mL。 10 mol/L 氢氧化钠溶液(200 mL) 在160 mL水中加入80 g氢氧化钠，溶解后加水定容至200 mL。 0.5 mol/L EDTA溶液(100 mL) 称取Na2EDTA·2H2O 18.6 g，加入70 mL 水中，再加入氢氧化钠溶液适量，加热溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，用水定容至100 mL。 CTAB提取缓冲液(1000 mL) 在600 mL 水中加入81.7 g 氯化钠，20 g CTAB，充分溶解后加入1 mol/L Tris-HCl溶液100 mL，0.5 mol/L EDTA溶液40 mL，用浓盐酸或氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000 mL，分装后高压灭菌。 CTAB沉淀缓冲液(1000 mL) 在800 mL 水中加入2.3 g 氯化钠，5 g CTAB，充分溶解后加水定容至1000 mL，分装后高压灭菌。 1.2mol/L氯化钠溶液(100 mL) 在60 mL 水中加入7.01 g 氯化钠，溶解后加水定容至100 mL，高压灭菌。 70%乙醇溶液(1000mL) 取700 mL 无水乙醇，加水定容至1000 mL。 TE缓冲液(1000 mL) 在800 mL 水中依次加入1 mol/L Tris-HCl溶液10 mL，0.5mol/L EDTA溶液2 mL，用浓盐酸或氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至1000 mL，分装后高温高压灭菌。 Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1（体