紫外分光光度法测核酸的含量.pptVIP

一、 紫外分光光度法测核酸的含量;? 一、 链终止法测序(the chain termination method);链终止法原理;If one ddGTP is added to 100 dGTP, DNA synthesis aborts at a frequency of 1/100 every time the polymerase meets a ddGTP ;末端终止法测序过程;? 印迹杂交技术的历史;核酸探针;一、探针种类;三、探针标记法;三、探针标记法;三、探针标记法;随机引物标记探针;三、探针标记法; 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序;一、DNA印迹法（Southern Blotting）;一、DNA印迹法（Southern Blotting）;二、RNA印迹法（Northern blotting ）;六、原位杂交;一、 基因芯片;（一）基因芯片的基本原理;（一）基因芯片的基本原理;原理 -- 通过杂交检测信息;核酸体外扩增——PCR反应;? PCR反应的原理;PCR的基本反应步骤;PCR特点;; 50-100 ?l 总体积 Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物（1对） DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 ;PCR标准反应体系;任何来源的、单链或双链、DNA或RNA经逆转录为cDNA都可以作为PCR反应的模板。 一般要求对目的DNA的序列要有一定的了解，以方便设计引物。 对DNA样品的要求较低，可以是菌体或细胞、体液的裂解物。;引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 ;①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特异性降低。 ②引物中碱基的分布是随机的，避免５个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在45～50％左右 ③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以免形成二聚体。; ④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。 ⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。;耐热DNA聚合酶：Taq；pFu； 酶的需要量可根据不同的模板复杂度或引物而变化。 优化PCR反应条件时，一般在每100μl反应体积中加入0.5～5U酶的范围内试验最佳酶浓度。酶浓度过高会导致非特异性扩增；酶浓度过低则扩增效果不佳。 PCR反应后灭活TaqDNA聚合酶。;?TaqDNA聚合酶的特性;? 经典循环参数（500bp以内）;循环参数;;三、产物分析;? 四、逆转录PCR（RT-PCR）;五、荧光定量PCR（FQ-PCR）;? Taqman技术;? Taqman技术;荧光定量PCR技术原理;? 主要的工具酶;GGATCC CCTAGG;回文结构(palindrome) ;GGATCC CCTAGG;Bam HⅠ;4、限制性内切酶的应用;当一个DNA分子含有6个拷贝的 GAATTC: 它将被酶切成7个片段，可用凝胶电泳方法将其分离。;二、DNA连接酶;三、分子克隆中常用的其他酶;;三、分子克隆中常用的其他酶; 6.DNA聚合酶Ⅰ 合成双链DNA分子 缺口平移法，获得高比活性探针 DNA序列分析 补平3′端 ;7.Klenow片段（DNA聚合酶Ⅰ大片段） 具有完整的DNA聚合酶活性 保留3′→5′外切酶活性 无5′→3′外切酶活性 Klenow片段的主要应用： 合成cDNA第二链 补齐双链DNA分子3′端或标记3′端 DNA序列分析;DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段;载体分类;? 载体的基本元件;? 载体的基本元件; 一、质粒载体;1、理想质粒载体的特点;（1） pBR322质粒载体;; 1.带有一个复制起始点（ori） 2.抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标志 3.数个单一的限制性酶切位点 4.较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。 5.较高的拷贝数 每个细胞达1000～3000个拷贝。;?(2)pUC质粒载体系列;;(2