和元公司慢病毒使用说明书.PDFVIP

    和元公司慢病毒使用说明书  2013年(第三版)    一、慢病毒的储存与稀释         1.  病毒的储存：收到病毒液后检查病毒液是否溶解并将其保存于-80℃。        ① 病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用 前重新测定病毒滴度。        ② 反复冻融会降低病毒滴度，因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。为避免反 复冻融，建议病毒第一次使用后，按照每次的使用量进行分装。        2.  病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出，并置于冰浴融解后，使用PBS(细 胞培养级)或培养目的细胞的无血清培养基。混匀分装后4℃保存(请尽量在3天内用完) 分 装后使用。    二、MOI介绍：  MOI：一般认为 MOI 是一个比值，没有单位，其隐含的单位是: 病毒有效颗粒数/cell。也 就是说平均感染每个细胞所使用的病毒颗粒数。  根据我们实验报告中提供的测定好的慢病毒的滴度（TU/ml），再根据MOI值（达到理想感 染效果时病毒数与细胞数目的比例）和预感染的细胞数目（N），这样病毒液的用量就很容 易计算了。  即： 所需病毒液的量（ml）＝MOI*N/慢病毒滴度      三、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：         感染原代细胞和细胞系。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可 以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，MOI 值以及在体内（In Vivo） 注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的 MOI 值  （使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。          慢病毒感染目的细胞预实验（MOI预实验）：        1.  慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：        ① 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞 (HEK293，293T，HeLa）作为平行实验的对照细胞。        ② 在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上， 含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。        ③ 一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒 8 8 滴度为1X10  TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X10 个具有生物活性的慢病毒颗粒。          2.  以24孔培养板为例，进行目的细胞和293T细胞的感染预实验前，按照不同的MOI 设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。        第 1 天 ，准备细胞：在 24 孔培养板接种若干孔(根据实验安排所需)，每个孔内接种 3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为30%左右，每孔培养基体积为500 μl；进行 病毒感染时细胞的融合度约为30-50%左右。        第2天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用掌上离心机离心20 秒（使病毒液聚集 到管底）；如果是保存在-80℃的病毒需要先在冰上或者4℃融化后使用。亦可以根据实验室 的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有 慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。       第2天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状 态，如细胞状态较好则开始实验。        a．使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。        b．吸去培养皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）。        c．在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。        d．混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2 ）孵育过夜。        注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响较大，所以务必保证加病毒之前 细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器 皿中。慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但 是当MOI高于20时，我们建议在培养基中加入ploybrene（1-10μg/ml左右）来提高病 毒的感染效率。Ploybrene对神经元（neurons）、树