延边膜荚黄芪rDNA ITS区域克隆与序列分析.pdfVIP

第 34卷 第 1期 Vo1．34No．1 2012年 3月 M ar．2O12 延边膜荚黄芪 rDNA ITS区域克隆与序列分析 金钟范 ， 王树斌 ， 杨洪亮 ， 邱菊 ， 吴松权 (1．延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2．吉林省大安市农业技术推广 中心，吉林 大安 131300) 摘要：用 PCR方法克隆延边地 区膜荚黄芪 的核糖体 DNA ITS区域并进行序列分析。结果表 明：延边地 区膜 荚黄芪 ITS1的序列长度为 228bp，5．8SrDNA长度为 164bp，ITS2的序列长度为 210bp；序列分析表 明延边 地 区和甘肃 的ITS1和 5．8SrDNA完全一致 ，而 ITS2第 82位处有 1个碱基的置换(T ／C) 关键词 ：膜荚黄芪 ；rDNA；内转录间隔区(ITS) 中图分类号 ：$567 文献标识码：A 文章编号 ：1004—7999(2012)01—0027—03 作为正品黄芪的膜荚黄芪 (AstragalusmembranaceuS(Fisch．)Beg)在我国主要分布在北方地区，具 有补气固表 ，利尿排脓，敛疮生肌的功效，不过其种质之间往往出现混杂现象 ]。目前，关于黄芪的研究多 集 中在有效成分和药理方面，对其DNA序列的研究较少。 被子植物 rDNA内转录间隔区(internaltranscribedspacer，ITS)是 18S和 28S核糖体 DNA的转录问 隔区，被 5．8S分为 ITS1和 1TS2两部分 ，近年来 已被广泛用于植物种内变异和种间分子系统学研究[3]。本 研究采用PCR扩增及测序技术对延边膜荚黄芪的rDNAITS进行序列测定与分析，为分子水平上比较不同 地区膜荚黄芪的差异，为膜荚黄芪的种质资源道地性鉴定提供科学依据。 1 材料与方法 1．1 材 料 1)植物材料 采 自延边大学农学院中草药圃地 ，取新鲜幼嫩膜荚黄芪叶片保存在一75℃冰箱备用 。 2)菌株与试剂 大肠杆菌(E．coli)JM109、胶 回收试剂盒、PMD18-T载体购于宝生物工程 (大连)有限 公司(TaKaRa)，DNA测序 由上海英俊生物公司完成 ，其它试剂为国产分析纯。 1．2方法 1)总 DNA 的提取 采用 CTAB法[4]，并稍作改进 。取 3g叶片，用液氮研磨并装入 5OmL离心管后 ， 加入提取缓冲液[2％CTAB；20mMEDTA；100mM Tris—HCI(pH值 8．O)；1．4MNaCI；1％PVP]15mL 和 一巯基乙醇 1O肛L，置 65℃水浴保温 45rain。加入等体积的氯仿 ／异戊醇(24：1)，剧烈震荡，在室温下冷 却。然后 10000r／rain离心 10min，取出的水相用氯仿 ／异戊醇(24：1)再抽提 1次。接着在抽提后的水相 中加入 2／3体积冰冷的异丙醇 ，静置于一2o℃，30min。然后在 10000r／min离心 5min，倾去上清液，加入 7O 的酒精洗涤沉淀，在滤纸上沥干。当沉淀无 乙醇味时加入 1×TE缓冲液 200 L、RnaseA 2 L，且 37℃保温 1h以裂解 RNA，最后在 4℃待用或一2O℃长期保存 。 2)PCR扩增 利用 ITS通用引物 ITS4(5’一 3’)(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和 ITS5(5’一 3’) (GGAAGTAAAAGTCGTAAcAAGG)进行序列扩增 ，ITS5位于 18S，ITS4位于 28S。扩增程序为：94℃ 预变性 5min；94℃变性 30S，52。C退火 30S，72℃延伸 1min，30个循环；最后 72。C延伸 5rain。反应体 系为 2O L：10×pcrbuffer2 L，dNTP2 L (10mM)，Taq酶 0．5 L (1U)，ITS42 L (2~／mol／L)， ITS52 L(2#mol／L)，模板 2 L(10ng)，其余用超纯净水补至 20 L。PCR产物上样于 1 琼脂糖凝胶 中5V／cm 电泳 ，待溴粉兰指示剂到达凝胶 2／3位置时停止电泳 ，用凝胶成像仪进行观测照相 。 收稿 日期：2011—12一ol 基金项 目：国家 自然科学基金项 目(3