山苍子AFLP反应体系的建立及其引物筛选.pdfVIP

林 业 科 学研 究 2012，25(2)：174～ 181 ForestResearch 文章编号：1001—1498(2012)02-0174-08 山苍子 AFLP反应体系的建立及其引物筛选 田胜平 ，汪阳东 ，陈益存 ，占志勇 ，斯林林 (1．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400；2．安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036) 摘要：通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾 3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主 要因素 (酶切时间、Mg2浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究，建立了适合于山苍子 AFLP分析的技术体系。结 果表明，山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料；山苍子基因组DNA经5UEcoRI和5UMseI酶切 1h即可完全酶 切 ；最佳的选择性扩增体系为20 L反应体系中含有 1．0UrTaq聚合酶、2．0 L10×PCR缓冲液、1．8ILL25 mmol·L～MgC1、1．4p,L2．5mmol·L～dNTP、100ng· 引物各 1．0 。使用该反应体系获得了清晰、稳定的 DNA指纹图谱，并筛选出10对多态性较好的AFLP引物组合，为利用AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结 构、遗传分化等研究奠定了基础。 关键词：山苍子；基因组DNA；AFLP；多态性引物 中图分类号：$718．46 文献标识码：A PrimerScreeningandAFLPAmplificationReactionSystem ofLitseacubeba TIAN Sheng-ping ，WANG Yang—dong ，CHEN Yi—cun ，ZHAN Zhi—yong ，SILin—lin (1．ResearchInstituteofSubtropicalForestry，ChineseAcademyofForestry，Fuyang 311400，Zh~iang，China； 2．SchoolofLifeScience，AnhuiA culturalUniversity，He 230036，Anhui，China) Abstract：TheeffectofDNA extractionwasanalyzedbycomparingtheyoungleaf，terminalbudandflowerofLitsea cubeba．ThetimeofDNA digestionand severalkeyfactorsaffectingthePCR selectiveamplificationsuchasMg concentration，dNTPsconcentrationandthemountoftheselectiveamplificationprimerwerealsotrialed．Anopti— mizedAFLPreactionsystem ofLitseacubebawasestablished．TheresultsshowedthatthehighqualitygenomicDNA asaPCR templatecouldbeisolatedfrom thebudtissue；genomicDNA couldbedigestedinahourby5U EcoR I and5U MseI；Theopticalselectionamplificationsystem was20 p,Lreactionmixcontaining1．0 U rTaqpolymer— ase，2．0 L10 ×PCR buffer，1．8p,L25mmol ·L_。MgC12，1．4 L2．5mmol·L～dNTP，100ng · L-。primer each1．0LLL．Clearandstableamplificationbandpatternscanbeobtainedand10pairsofAFLPprimerswithgood geneticdiversitywereselectedaccordingtotheoptimizedreactionsystem．Th eresultswillbeaneffectiveprotocol forfurtherstudyingthegeneticstructureanddifferentiationofLi