晒烟RAPD反应体系的优化.pdfVIP

第 34卷 第 1期 Vo1．34No．1 2012年 3月 M ar．2O12 晒烟 RAPD反应体系的优化 王曼 ， 金东淳 ， 朴世领 ， 金爱兰 (1．延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2．延边朝鲜族 自治州农业科学院，吉林 龙井 133400) 摘要：以晒烟苗期幼叶为试材，通过设置不同的模版DNA、引物、dNTP、Mg 及 TaqDNA聚合酶的浓度梯 度，优化 RAPD的反应条件，建立 1个适合晒烟的比较稳定的RAPD反应体系。结果表明，适合晒烟 RAPD 的反应体系是在 25 “L反应体系中，含模板 4ong；引物 UBC-3881．5IxL；Mg 1．6mM；dNTP0．2mM；Taq 酶 1U。 关键词 ：晒烟 ；RAPD；体系；优化 中图分类号 ：$572 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004—7999(2012)01—0071—04 随机扩增多态性 DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)技术是 1990年 由美国Williams_l1] 和加利福尼亚生物研究所 Welshc幻建立在PCR技术基础上的一项新的DNA分子标记技术 。该技术 以 lO 个碱基的核苷酸序列为引物，对未知序列的基因组DNA进行PCR扩增，得到多态性DNA片段。与其它分 子标记技术相比，该法具有操作简单 ，DNA需求量少等特点，被广泛应用于基因组作图 ]、基因定位[4]、生物 遗传育种_5]、文库构建 、基因克隆等研究领域 。但 RAPD对实验程序和条件变化较敏感 ]，进行 RAPD分析 时，首先要建立一套稳定的反应体系。前人[7]对烤烟的RAPD分析做了很多报道 ，但利用 RAPD对晒烟 扩增条件的优化研究 尚未见报道 。因此 ，本试验 以东北晒烟为材料，探讨模板、dNTP、引物、Mg抖浓度和 Taq酶等因子对其扩增结果的影响，优化 RAPD反应体系，为利用该技术对晒烟进一步研究奠定基础 。 1 材料与方法 1．1 材料 东北晒烟 (风林一号)，由延边朝鲜族 自治州农业科学院烟草研究所提供 ；所用引物来 自哥伦 比亚大学 (UBC)设计并公布的301-400号引物序列；Taq酶、25mM MgC12、10×buffer、dNTP、Marker和琼脂糖凝胶 均购 自宝生物工程 (大连)有限公司，植物基 因组 DNA提取试剂盒购 自南京奥多福尼生物科技有限公司。 1．2 仪器 DYY一12型电泳仪 、电泳槽 (北京六一仪器厂)；全 自动凝胶成像分析系统 (美 国Bio—Rad公司)；wI)_ 9402APCR梯度扩增仪 (北京市六一仪器厂)。 1．3 方法 1)模板 DNA的提取 采用试剂盒法提取基因组 DNA。 2)RAPD反应体系的优化 采用单因素递进筛选法，对扩增反应 中的某些重要参数进行优化设计(表 1)，对其 中1个因子进行梯度设置时，严格控制其它参数和反应条件 ，并相应地调整超纯水量，以保持反应体 系为 25 L，覆盖 10 L石蜡油。扩增在 WD-9402A扩增仪上进行。RAPD-PCR反应扩增程序为：94。C预 变性 5min；然后 94℃变性 1rain，40℃复性 45S，72℃延伸 9OS，40个循环；最后 72℃延伸 7rain。 3)PCR扩增结果 取 18 L扩增产物和 3 L6×LoadingBuffer混匀 ，点入含有 0．5／lg／mLEB的 1．5 琼脂糖凝胶，180V 电泳 1h，取出凝胶，在美国Bio—Rad全 自动凝胶成像仪上照相分析。 收稿 日期 ：2O11一l11 28 基金项 目：上海烟草集 团有限责任公司 (SZBCW2011--00599) 作者简介 ：王曼(1988～)，女，吉林磐石人 ，延边大学农学院农学系，在读硕士 。朴世领为通讯作者 ， Tel：0433 2733375，E—maiI：pslpjj@ybu．edu．cn 72 延 边 大 学 农 学 学 报 第 34卷 2